3.2 基因工程的基本操作程序ppt课件-（新教材）2019新人教版高中生物选择性必修三.pptx

1、3.2 基因工程的基本操作程基因工程的基本操作程序序DNA合成仪合成仪显微注射技术显微注射技术从社会中来 19971997年，我国政府首次批准年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到商业化种植转基因抗虫棉。到20152015年，我国已育成转基因抗虫年，我国已育成转基因抗虫棉新品种棉新品种100100多个，减少农药用多个，减少农药用量量4040万吨，增收节支社会经济效万吨，增收节支社会经济效益益450450亿元。亿元。 你知道转基因抗虫棉抗虫的你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花转基因

2、抗虫棉与普通棉花 培育转基因抗虫棉的简要过程： 苏云金芽苏云金芽孢杆菌孢杆菌抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )3.2 基因工程的基本操作程序（四个步骤）四个步骤）目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进

3、入受体细胞稳定表达，才能载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。细胞中稳定遗传和正确表达。前提前提核心核心关键关键保证保证一、目的基因的筛选与获取与生物与生物抗逆性抗逆性相关的基因（相关的基因（BtBt抗虫基因）抗虫基因）与与优良品质优良品质相关的基因相关的基因与生物与生物药物药物和保健品相关的基因和保健品相关的基因（与与毒物降解毒物降解相关的基因相关的基因与与工业用酶工业用酶相关的基因等相关的基因等非编码区非编码区非编码区非编码区启动子

4、：启动子：RNARNA聚合酶的识聚合酶的识别和结合位点别和结合位点 开始转录开始转录编码区编码区原核生物基因原核生物基因终止子：终止子：终止转录终止转录补充知识：补充知识：基因结构：基因结构：非编码区非编码区组成：编码区组成：编码区上游上游与编码区与编码区下游下游功能：功能：不能编码不能编码蛋白质，蛋白质，遗传信息的表达遗传信息的表达启动子：启动子：RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点 转录起始的信号转录起始的信号终止子：终止子：终止终止RNARNA的合成的合成编码区：编码蛋白质的合成编码区：编码蛋白质的合成加加 工工转转 录录mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA非编码区非编码

5、区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5启动子启动子终止子终止子补充知识：补充知识：基因结构：基因结构：原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码注意注意1 1、非编码序列：、非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子2 2、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核

6、细胞与真核细胞基因 结构一样长吗？结构一样长吗？思考思考从生物细胞中直接获取从生物细胞中直接获取人工合成人工合成5.目的基因获取方法：目的基因获取方法：4目的基因的来源：目的基因的来源：（一）从基因文库中获取；（一）从基因文库中获取；（二）通过（二）通过DNADNA合成仪直接合成合成仪直接合成（三）利用（三）利用PCRPCR技术扩增；技术扩增；一、目的基因的筛选与获取反转录法反转录法据已知的氨基酸序列推测合成据已知的氨基酸序列推测合成DNA通过通过DNA合成仪合成合成仪合成1.1.基因文库基因文库概念：概念： （未知序列）（未知序列）（）（cDNA文库）文库）提取某种生物的全部提取某种生物的全

7、部DNADNA一定大小的一定大小的DNADNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存用适当的限制酶切用适当的限制酶切将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接基因组文库基因组文库基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模式图3.部分基因文库构建模式图部分基因文库构建模式图4.5.5.基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库的构建过程比较文库的构建过程比较cDNAcDNA文库文库以以原核生原核生物物为主为主真核生物真核生物人工合成人工合成鸟枪法鸟枪法基因组基因组DNA文库文库cDNA文库文库6. 基因文库的构建过程基因文库的构建过程某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNAD

8、NA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体与运载体 连接导入连接导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体与运载体 连接导入连接导入部分基因文库（部分基因文库（cDNA文库）文库）小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基某种生物的部分基因因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。 如：如：根据基因的核苷酸序列根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录

9、产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性8、从基因文库中得到目的基因的方法、从基因文库中得到目的基因的方法2. 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成3、人工合成法DNA合成仪合成仪1 1、前提、前提：基因比较小、核苷酸序列已知基因比较小、核苷酸序列已知（序列已知）（序列已知）2 2、方法：、方法：通过通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成目的基因合成仪用化学方法直接合成目的基因1）DNA序列自动测序仪：序列自动测

10、序仪：2）PCR技术：技术：（三）（三）. .利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1、 概念：表表3-1 DNA复制所需的基本条件复制所需的基本条件参与的组分参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋酶（体外用高温代替）解旋酶（体外用高温代替）打开打开DNA双链双链DNA两条母链两条母链提供提供DNA复制的模板复制的模板4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成合成DNA子链的原料子链的原料DNA聚合酶聚合酶催化合

11、成催化合成DNA子链子链与两条母链结合的与两条母链结合的2种引物种引物使使DNA聚合酶能够从引物聚合酶能够从引物端连接脱氧核苷酸端连接脱氧核苷酸3、方式：2、 条件以指数方式扩增，即以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）2n4、 PCR过程：过程： 变性、复性、延伸三步曲变性、复性、延伸三步曲变性：变性：90909595复性：复性：55556060延伸：延伸：70707575变性变性复性复性延伸延伸变性变性 （90-9590-95）复性复性延伸延伸5 5 5 5 （55-6055-60）（70-7570-75）5 5、PCR PCR 的一轮扩增的一轮扩增1.1.变性：变性

12、：目的基因目的基因DNADNA受热变性，解链为单链；受热变性，解链为单链；2.2.复性：复性：引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.3.延伸：延伸：合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。a.a.变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，断裂， 形成形成_b b、复性、复性（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板模板 结合，形成局部结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，合成与模板互补的酶的作

13、用下，合成与模板互补的 _ _。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链6、利用PCR获取和扩增目的基因过程： A T C G A A T C G G T T U A C C T T A G C C A A DNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3355知识回顾知识回顾-DNA复制过程模板DNA利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：50引物1引物2DNA引物95利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：72第1轮结束第2轮开始利用利用P

14、CR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：955072TaqTaqTaqTaq利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：72第2轮结束利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：利用利用PCR获取和扩增目的基因过程：获取和扩增目的基因过程：8 8、PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原则原则原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在在高温高温下变性解旋下

15、变性解旋解旋酶解旋酶催化催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定热稳定的的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子从从基因文库基因文库中寻找中寻找聚合酶链式反聚合酶链式反应（应（PCRPCR）扩增）扩增化学合成法化学合成法目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列未知未知目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列已知已知小结：小结：获取目的基因的常用方法有哪些获取目的基因的常用方法有哪些? ?初始目的基因的来源初始目的基因的来源1. 从生物中直接获取从生物中直接获取2. 人工合成人工合成注意：要保持基因的

16、完整性注意：要保持基因的完整性二、二、基因表达载体的构建基因工程的基因工程的核心核心1、目的：2 2）使目的基因能够）使目的基因能够表达表达和发挥作用。和发挥作用。2、组成：a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，且使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以可以 遗传遗传给下一代给下一代载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构

17、。因、启动子、终止子三部分结构。注意：注意：用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。酸二酯键。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方必需以表达载体的方式携带进去。式携带进去。思考思考1：表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？(1)(1)生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动

18、子才能有利于基因的表达；（2 2）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。位于基因首端的一段特殊的位于基因首端的一段特殊的DNA片断片断，它是，它是RNA聚合酶识聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。 1、启动子：操纵基操纵基 因因结构基因结构基因 启动子启动子RNA聚合酶聚合酶是为了是为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞因的细胞筛选筛选出来。出来。思考思考3：标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？思考思考2 2：终止子的

19、作用是什么？终止子的作用是什么？ 终止子是位于终止子是位于基因尾端基因尾端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片断，能片断，能终止终止mRNAmRNA的转录的转录。基因表达载体的构建过程两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因质粒质粒DNADNA分子分子限制酶限制酶处理处理DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（分子（重组重组质粒）质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端思考用用DNADNA连接酶处理后会出现几种产物？连接酶处理后会出现几种产物？( (只考虑两两结合只考虑两两结合) )如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？如何避免质粒的自我环化和目的基因反

20、向连接的问题？（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细胞内维内，并且在受体细胞内维持持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物微生物细胞细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，可以转移

21、到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNA上。上。易感染易感染双子叶植物双子叶植物和裸子植物，对大多和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。数单子叶植物没有感染能力。TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌转化过程转化过程: :具有趋化性（酚）具有趋化性（酚）基因枪法又称微弹轰击法，是基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力利用压缩气体产生的动力，将，将包裹在金属颗粒表面的表达载包裹在金属颗粒表面的表达载体体DNADNA打入受体细胞中打

22、入受体细胞中，使目的，使目的基因与其整合并表达的方法。基因与其整合并表达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。基因借助花粉管通道进入受体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞(1)方法：显微注射法方法：显微注射法提纯提纯含目的基因表达载体含目的基因表达载体受精卵受精卵显微注射显微注射移植移植到输卵管或子宫到输卵管或子宫受精卵发受精卵

23、发育育新性状动物新性状动物（2）操作操作:显微注射技术显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞（1 1）微生物作受体细胞原因：）微生物作受体细胞原因：（2 2）常用法）常用法： CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌： 大肠杆菌大肠杆菌（增加细胞壁的透性，与细胞膜无（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）关）（3）过程：）过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体

24、细胞导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/ /个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理处理成感受态细成感受态细胞胞小结小结：四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检查是否成功检查是否成功检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA 上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因1 1、检测转基因生物、检

25、测转基因生物染色体染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示出若显示出杂交带杂交带, ,表明表明目的目的 基因已插入染色体基因已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测15151515方法方法: : 分子杂交分子杂交过程过程: :用

26、上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, , 表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。蛋白质蛋白质脱分化脱分化提提取取苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白抗体抗体 出现出现杂交带杂交带鉴定鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。虫基因并得到表达。 质粒的多克隆位点整合在质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，在多克隆位点基因中，在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。形成白色的克隆。 否则形成蓝色克隆。否则形成蓝色克隆。典典型型例例题题