医学免疫学课件：免疫学检测原理及临床应用.ppt

1、 免疫学检测指借助免疫学、细胞生免疫学检测指借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对抗物学、分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。定性、定量检测。 一、抗原抗体检测一、抗原抗体检测二、免疫细胞检测二、免疫细胞检测三、免疫分子检测三、免疫分子检测四、免疫相关基因检测四、免疫相关基因检测 用已知抗原检测未知抗体，诊断有关疾病用已知抗原检测未知抗体，诊断有关疾病用已知抗体检测未知抗原，鉴定病原体或用已知抗体检测未知抗原，鉴定病原体或辅助诊断疾病辅助诊断疾病 抗原抗原- -抗体反应的特点与影响因素抗体反应的特点与影响因

2、素反应条件：反应条件： 适当的温度适当的温度 电解质电解质 酸碱度酸碱度特点：特点： 特异性特异性 可逆性可逆性 阶段性阶段性 可见性（合可见性（合适的抗原抗体比适的抗原抗体比例）例）亲和力与亲合力（亲和力与亲合力（affinity & avidity） 亲和力亲和力(affinity) 是指一个抗体上一个是指一个抗体上一个抗原结合位点与抗原决定抗原结合位点与抗原决定基之间的结合强度。基之间的结合强度。AbAgHigh AffinityAbAgLow Affinity 亲合力亲合力(avidity) 是指一个抗体分子与是指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。整个抗原之间的结合强度。Keq =

3、104Avidity106Avidity抗原抗体反应的基本检测方法抗原抗体反应的基本检测方法（一）（一） 凝集反应凝集反应 颗粒性抗原颗粒性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下与相应的抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的凝集块。形成肉眼可见的凝集块。（二）（二） 沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原可溶性抗原与相应的抗体结合后，在一定条件与相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀线或沉淀物。下出现肉眼可见的沉淀线或沉淀物。（三）（三） 补体参与的反应补体参与的反应（四）（四） 免疫标记技术免疫标记技术凝集反应凝集反应(agglutination)直接凝集直接凝集间接凝集间接凝集间接凝集抑制间接凝

4、集抑制 自身免疫性溶血性贫血（自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是一组）是一组B淋巴细淋巴细胞功能异常亢进、产生抗自身红细胞抗体、使红细胞胞功能异常亢进、产生抗自身红细胞抗体、使红细胞破坏增加而引起的贫血。破坏增加而引起的贫血。抗人球蛋白抗人球蛋白抗抗RBC抗体抗体RBC直接抗球蛋白试验（直接抗球蛋白试验（DAT） 阳性（右）阳性（右）间接凝集反应间接凝集反应沉淀反应沉淀反应(precipitation) 单扩的原理单扩的原理双扩的原理双扩的原理免疫电泳免疫电泳补体结合试验补体结合试验 补体参与的反应补体参与的反应溶血空斑试验溶血空斑试验 补体依赖细胞毒实验（已操作）补体依赖细胞毒实验（已操作）

5、 淋巴细胞毒交叉配合试验淋巴细胞毒交叉配合试验lymphocyte cross matching将含有细胞毒抗体的受者血清与供者的淋巴细胞加入补体后一起培养。一般要求死亡细胞少于15%。若高于15%，移植后可能出现超急性排斥反应。免疫标记技术免疫标记技术 colloidal gold 免免疫疫荧荧光光技技术术酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 世界上唯一用世界上唯一用ELISA方法检测方法检测SARS抗原抗原的试剂盒，发病第一天即可检出的试剂盒，

6、发病第一天即可检出检测检测-地贫的标志蛋白地贫的标志蛋白 Zeta链蛋链蛋白，其检测结果可作为诊断白，其检测结果可作为诊断-地贫地贫的基本依据。的基本依据。BAS-ELISA酶联酶联免疫免疫斑点斑点试验试验(ELISPOT)ELISPOT 和和 ELISA的区别的区别 ELISPOT 法源自法源自 ELISA ，又突破传统，又突破传统 ELISA 法，法，是定量是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最技术的延伸和新的发展，它们最大的不同大的不同: ELISA测定的是测定的是蛋白浓度蛋白浓度，ELISPOT测定的是测定的是细胞频率细胞频率；（整体水平与单细胞水平）；（整体水平与单细胞水平

7、） ELISA是免疫检测是免疫检测Immuno-Assay，而，而ELISPOT是生物检测是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）（活细胞，功能检测）乳腺癌的乳腺癌的CerbB2抗体免疫组化抗体免疫组化DAB染色染色 免疫组化技术免疫组化技术 (immunohitochemistry techenique)放射免疫测定法放射免疫测定法(radioimmunoassay， RIA) 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 免疫印迹法免疫印迹法(immunoblot) 免疫层析检测原理免疫层析检测原理一、免疫细胞分离及其亚类计数一、免疫细胞分离及其亚类计数 (一一) 外周血单个核细胞（外周血单个

8、核细胞（ PBMC）的分离）的分离（二）淋巴细胞亚群的分离（二）淋巴细胞亚群的分离 尼龙棉分离法尼龙棉分离法 E花结分离法花结分离法 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry，FCM)流式细胞术流式细胞术(flow cytometry，FCM)磁分离技术磁分离技术（三）淋巴细胞亚群计数（三）淋巴细胞亚群计数免疫荧光技术（免疫荧光技术（IF）补体依赖微量细胞毒试验补体依赖微量细胞毒试验流式细胞术（流式细胞术（FCM）花环试验花环试验 用用FITC-抗抗IgM单抗计数单抗计数B细胞细胞二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定体外试验体外试验淋巴细胞增值试验淋巴细胞增值试验细胞毒试验细胞毒

9、试验分泌功能测定分泌功能测定3H-TdR渗入法渗入法MTT法法形态学计数法形态学计数法51CR释放法释放法乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法细胞凋亡检查法细胞凋亡检查法检测细胞因子分泌细胞检测细胞因子分泌细胞检测抗体形成细胞检测抗体形成细胞体内试验：皮试体内试验：皮试二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定 （一）淋巴细胞功能测定的体外试验（一）淋巴细胞功能测定的体外试验 1. 1. 淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验刺激物刺激物 * 非特异性：丝裂原非特异性：丝裂原PHA、Con A和和PWM，抗抗CD2、CD3单抗，同种单抗，同种MHC等等 * 特异性：破伤风类毒素、特异性：破伤风类毒素、PP

10、D、白色念珠菌、肿瘤白色念珠菌、肿瘤细胞等细胞等方法：核素掺入法、方法：核素掺入法、MTT法和形态学计数法法和形态学计数法淋巴淋巴细胞细胞增殖增殖实验实验（核（核素掺素掺入法）入法）2. CTL、NK细胞可直接杀伤靶细胞（如肿瘤细胞可直接杀伤靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等）细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等） 51Cr释放法释放法 LDH释放法释放法 细胞凋亡检查法细胞凋亡检查法DNA Ladder电泳图谱电泳图谱TUNEL法检测凋亡细胞法检测凋亡细胞 流式细胞术流式细胞术-Annexin-V/PI双染法双染法 凋亡早期，细胞表面变凋亡早期，细胞表面变化化 ，磷脂酰丝氨酸，磷

11、脂酰丝氨酸（PSPS）外翻。）外翻。 ANNEXIN VANNEXIN V是种磷脂结是种磷脂结合蛋白，作为探针能识合蛋白，作为探针能识别凋亡细胞。别凋亡细胞。 细胞对细胞活性染料细胞对细胞活性染料（如（如PIPI）有拒染性。而）有拒染性。而坏死细胞能被坏死细胞能被PIPI染色。染色。（二）淋巴细胞功能测定的体内试验（二）淋巴细胞功能测定的体内试验迟发型超敏反应皮肤试验迟发型超敏反应皮肤试验特异性特异性: PPD皮试、过敏原皮试皮试、过敏原皮试非特异性非特异性: PHA 皮试、皮试、DNCB皮试皮试（三）抗原特异性（三）抗原特异性T淋巴细胞检测淋巴细胞检测MHC/多肽四聚体技术（多肽四聚体技术（

12、Tetramer-Technology） T细胞表面的T细胞受体( TCR)可特异性识别、结合抗原提呈细胞或靶细胞表面的MHC-抗原肽复合物。 体外将MHC分子与抗原肽进行复性重叠形成MHC-肽复合物。用荧光素标记的亲和素把四个MHC-肽单体形成MHC四聚体可以结合到特异性的CTL表面。 一、免疫球蛋白的测定一、免疫球蛋白的测定单扩，单扩，ELISA、RIA，免疫电泳等，免疫电泳等二、补体测定二、补体测定单扩，单扩，ELISA、RIA， CH50 三、细胞因子检测三、细胞因子检测 1. 1. 免疫学测定法免疫学测定法分泌性细胞因子检测：分泌性细胞因子检测：ELISA, RIA, ELISPOT

13、, WB, immuno-PCR胞内细胞因子检测：胞内细胞因子检测：FCM2. 2. 生物活性测定法生物活性测定法 促进细胞增殖和增殖抑制法促进细胞增殖和增殖抑制法, 抗病毒活性测定抗病毒活性测定法法, 直接杀伤法直接杀伤法, 趋化活性测定法趋化活性测定法胞内细胞因子的检测胞内细胞因子的检测LPS活化单核细胞内活化单核细胞内TNF-的测定的测定R1：淋巴细胞；：淋巴细胞；R2：单核细胞：单核细胞Cytokine networkLab Invest 2003, 83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)四、四、CD分子、表面受体和黏附分子的检测分子、表面受体和黏附

14、分子的检测细胞表面分子：间接免疫荧光法，流式细胞术细胞表面分子：间接免疫荧光法，流式细胞术等等可溶性分子：可溶性分子：ELISA等等五、五、HLA分型分型方法：血清学方法，细胞学方法方法：血清学方法，细胞学方法应用：同种移植供受者配型，亲子鉴定，某些应用：同种移植供受者配型，亲子鉴定，某些疾病研究疾病研究 一、细胞因子基因组一、细胞因子基因组DNA或或mRNA检测检测Northern 杂交，原位杂交，杂交，原位杂交，PCR扩增产物杂交分析等扩增产物杂交分析等二、二、TCR及及BCR克隆性基因重组分析克隆性基因重组分析Southern 杂交，杂交，PCR 三、三、HLA等位基因分型技术等位基因分

15、型技术利用抗原与相应抗体可以特异性结合的特点建立利用抗原与相应抗体可以特异性结合的特点建立多种检测方法。多种检测方法。抗原抗体反应分为凝集反应和沉淀反应，而免疫抗原抗体反应分为凝集反应和沉淀反应，而免疫标记技术具有灵敏度高，能定性、定量等优点，标记技术具有灵敏度高，能定性、定量等优点，应用十分广泛。应用十分广泛。免疫细胞具不同表面标志，利用特异性抗体可鉴免疫细胞具不同表面标志，利用特异性抗体可鉴别不同的细胞群体及其数量；体外功能试验反映别不同的细胞群体及其数量；体外功能试验反映某一细胞群的功能，体内功能试验可反映整体免某一细胞群的功能，体内功能试验可反映整体免疫功能水平。疫功能水平。免疫分子的检测可采用免疫学方法、生物活性测免疫分子的检测可采用免疫学方法、生物活性测定法及分子生物学方法。定法及分子生物学方法。 1. 名词解释：沉淀反应，凝集反应，名词解释：沉淀反应，凝集反应， ELISA， immunoblot (Western blot)2. 抗原抗体反应有哪些特点？哪些基本类型？抗原抗体反应有哪些特点？哪些基本类型？3. 免疫标记技术的意义，有哪些免疫标记技术？免疫标记技术的意义，有哪些免疫标记技术？4. 有哪些方法可检测有哪些方法可检测T、B细胞的功能？细胞增殖试细胞的功能？细胞增殖试验和细胞毒性试验各有哪些基本方法？验和细胞毒性试验各有哪些基本方法？