生物大分子课件：bio-coures-2.ppt

1、蛋白质（多肽）的合成蛋白质（多肽）的合成蛋白质的合成化学合成生物合成由不同氨基酸按一定顺序的控制合成蛋白质（多肽）的化学合成由一种或几种氨基酸聚合或共聚合液相合成法：液相合成法：在有机溶剂中进行的均相反应固相合成法：固相合成法：以不溶性高聚物为载体，尽可能以统一的自动化方法在短时间内合成意义和基本步骤意义和基本步骤 多肽的全合成可验证新的多肽结构设计新的多肽，用于研究结构和功能的关系 为多肽生物合成反应机理提供重要信息 建立模型酶 合成新的多肽药物 氨基、羧基和侧链基团的保护 羧基的活化和形成酰胺键的缩合反应 重复上述反应以形成更多的酰胺键 脱除保护基团，得到最终产物目标多肽氨基酸之间反应的复

2、杂性氨基酸之间反应的复杂性DCC：N,N-二环己基碳二亚胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide）对暂时勿需参与反应的活性基团的保护和对参与形成酰胺键的羧基进行活化，是成功合成具有特定氨基酸顺序的多肽的两个基本条件。保护基团的原则保护基团的原则能与被保护基团结合除去时不影响肽链氨基的保护氨基的保护氨基的亲核性很强，其经酰化后，亲核性消失。因此对游离氨基实施酰基化，是保护氨基的基本方法1. 叔丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl group, 简称t-Boc)t-Boc基团可以在温和的酸性条件下被除去，产物容易分离氨基的保护氨基的保护2. 苄氧羰基(carbob

3、enzoxy group, 简称CBz)氨酯结构CBz基在弱酸性条件下比较稳定，在催化氢解时可被除去，产物也容易分离注意CBz的除去条件与t-Boc的不同!常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团保护基保护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件t-BocH2/Pd 或碱或碱HBr+CH3COOH 或或CF3COOHCBzCF3COOH 或碱或碱HBr+CH3COOH或或 H2/PdBPoc碱碱CH3COOH+HCOOH,CF3COOH 或或 HBrNa-NH3, H2/Pd, HCl或或 HBr+CH3COOHNH2NH2-H2O常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团保护基保

4、护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件TosylHBr+CH3COOH 或碱或碱Na-NH3Trityl碱碱H2/Pd 或或CH3COOH(80%)H2/Pd 或或 Na-NH3NH2NH2+醇醇+酸酸温和碱性条件温和碱性条件羧基的保护羧基的保护氨基酸中的羧基一般是以成盐（钾盐、钠盐、三乙胺盐等，临时性）或成酯的方式被保护。氨基酸甲酯和乙酯是将氨基酸与甲醇或乙醇在盐酸存在下反应制得。氨基酸苯甲醇酯（benzyl ester, 苄酯）：先生成氯亚硫酸酯羧基的保护羧基的保护叔丁醇酯（t-butyl ester）的制备一般采用酯交换法保保护护基基缩缩写写名名称称在在以以下下

5、条条件件稳稳定定除除去去条条件件BzlCF3COOHH2/Pd或或碱碱（有有副副反反应应）t-BuH2/PdCF3COOHH2/Pd或或酸酸NH2NH2-H2O或或碱碱（有有副副反反应应，易易消消旋旋和和肽肽键键断断裂裂）侧基的保护侧基的保护, -COOH of Glu and AspGlu(OMe)Glu(OBut)Glu(OBzl), Asp(OBzl)-OH of Ser and ThrSer(Bzl)Ser(But)Thr(Bzl)His的咪唑基：His(CBz), His(Tos, 对甲苯磺酸基)保护至最后-NH2 of Lys：Tos；在Na-NH3中除去，在催化氢化或HBr/HA

6、c除-NH2的保护基CBz时不受影响-SH of Cys：Bzl (Na-NH3中除去); MBzl(对甲氧苄基，HF、0C、30min除去); Trt(三苯甲基) 羧基的活化羧基的活化正常条件下，氨基酸的羧基和氨基之间不会自发形成肽键，故两者必须有一转变为更活泼的形式。由于活化氨基的反应激烈，且常常产生消旋化，通常将羧基活化。其共同的驱动力为碳原子亲电性的加强：由于活化取代基X的负诱导效应，被活化基团中原来的低电子密度进一步降低，形成的亲电中心允许亲核的非离子化氨基对它进行攻击。合成肽的常规方法是从C端向N端进行肽键的形成肽键的形成1. 羧基活化法酰氯法实际中很少应用，因为容易引起氨基酸消旋

7、化酸酐法由于有两个亲电中心，形成肽键时有等量的副产物解决方法：仍有氨基酸消旋化的问题酰基叠氮法优点是不易引起氨基酸的消旋化缺点是？酰基叠氮在使用和储存时易分解，但可进一步将其变为活性酯活性酯法另一种重要的活性酯活性酯与氨基反应形成的酰胺键偶联剂和肽键的形成偶联剂和肽键的形成偶联剂：偶联剂：一种能帮助羧基和氨基之间脱水和缩合的试剂碳二亚胺(carbodiimides)：一类偶联剂的总称，结构通式为分子的中心碳原子具有亲电性，容易受亲核试剂进攻，因而碳二亚胺可与各种弱酸加成类似酸酐结构类似酸酐结构碳二亚胺与羧基反应，形成不稳定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应碳二亚胺与羧基反应，形成不稳

8、定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应由第二分子酸由第二分子酸进攻形成酸酐进攻形成酸酐（脲）与胺直接反应形成酰胺键与胺直接反应形成酰胺键最常用的是N,N-二环己基碳二亚胺(DCC):DCC作为偶联剂合成作为偶联剂合成二肽的反应过程二肽的反应过程在温和反应条件在温和反应条件(0 C)下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与DCC不发生作用，但不发生作用，但可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。DCU不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物分离。分离。Woodward试剂：本身是一种脱水剂。先在碱

9、的作用下开环，形成一类似于碳二亚胺的活性碳原子：Woodward 试剂的应用范围比DCC小。优点是方法简便，产率高；缺点是容易产生消旋化。多肽合成的策略多肽合成的策略 肽肽链链逐逐渐渐增增加加法法 片片段段组组合合法法 g-h a-b c-d e-f g-h f-g-h a-b-c-d e-f-g-h e-f-g-h, , a-b-c-d-e-f-g-h a-b-c-d-e-f-g-h 产产率率： 7（81） （8 为多肽中氨基酸残基数； 为偶联反应的平均产率） 3（log28） 保保护护基基团团去去除除 每加入一个新氨基酸残基前须除去一个氨基保护基 两个肽段缩合前，须除去一个肽段的氨基和另一

10、肽段的羧基保护基 消消旋旋化化 可能性较小，可用各种偶联剂 可能性较大，必须选择 DCC 等不易引起消旋化的偶联剂 对对偶偶联联反反应应的的要要求求 每一步偶联反应较易进行，但要求高产率 片段多肽之间偶联较难进行，但对每一步反应产率要求不高 对合成相对分子质量不大的多肽，两种方法均可采用；而若合成相对分子质量大的多肽，一般采用片段组合法：合成含有32个氨基酸残基的多肽，若要求总产率为30%，对于片段组合法和逐步增长法，其每一步的产率分别要求为78%和96%左右。多肽固相合成法多肽固相合成法Merrifield合成法：合成法：所要合成的目标多肽的C端氨基酸的羧基（氨基被保护）以共价键形式与一个不

11、溶性的高分子树脂相连；脱除氨基保护基后，以此氨基酸的氨基为多肽合成的起点，同其它氨基酸（氨基被保护）已活化的羧基作用形成肽键。不断重复此过程，即可得目标多肽产物。优点反应时间短易实现自动化蛋白质自动合成仪无需溶解（选择溶剂）和精制中间体缺点适合于合成1520肽；当合成肽较大时，纯度不高。常选择PS为载体，在树脂的苯基上引入氯甲基，将目标多肽的C端羧基与苄氯作用形成苄酯，第二个氨基酸的氨基用叔丁氧羰基保护后，以DCC为缩合剂而形成肽键。重复此程序。合成的最后一步，是将树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥HBr，即可将多肽从树脂上解脱，同时残存的保护基也被去掉。多肽固相合成和液相合成的比较多肽固相合

12、成和液相合成的比较羧基递增方式羧基递增方式：把氨基酸N端的氨基以共价键连于固相载体，活化其羧基与下一个氨基酸的氨基缩合。将侧链功能基团连于固相载体：将侧链功能基团连于固相载体：i.e.二硝基苯为桥将组氨酸的咪唑基连于固相载体。此法既可以双向伸长肽链，又有利于肽的环化（二硫键的生成），同时也可在温和条件下从载体上裂下肽段。组合合成法合成多肽组合合成法合成多肽组合合成法：组合合成法：由于多肽及蛋白质在生命过程中的特殊作用，特别是在药物化学和分子生物学等领域的研究中，需要获得大量的不同结构的多肽，以便进行结构与活性关系研究和生物活性的筛选。因此，合成单一产物的传统合成方法已经不能满足要求。近十年来，

13、化学家们在多肽固相合成法基础上，发展成一种新的多肤组合合成法建立肽库。组合合成法合成多肽主要有两条途径：并行合成法并行合成法(parallel synthesis)和均分合成法均分合成法(split synthesis)。前者合成速度较慢，合成容量小，现在已经很少应用。均分合成法的基本原理基本原理是：每一个合成步骤分别合成出x组中间体，混合均匀后再平均分成x份，分别延长一个结构单元。反应产物再混合均分成x份，再延长一个结构单元，直至完成全部合成。合成目标：合成目标：C-端为Ala，其他三个氨基酸组成为G1u，Phe和Lys的四肽。这种类型的四肽库共有异构体数目应为3327个。近年来，均分法合成

14、多肽的技术发展很快。现在已经可以应用该技术同步合成上百万个多肽分子，并同时进行生物活性筛选。例如应用改进的均分法成功地合成了五肽库。首先将19种氨基酸(由于Cys容易氧化形成交联二硫键，在该合成中未采用)分别连接在树脂上，得到19个树脂-氨基酸。将其混合均匀并脱除保护基后，均分成19份，分别与19种氨基酸(氨基和侧链必须保护)进行缩合反应，可以得到1919=361个树脂-二肽。重复上述步骤三次(混合、脱保护基、均分和与19种氨基酸缩合)，即可合成出195=2,476,099个树脂-五肽。在脱除保护基后，多肽不必从树脂上分离，即可直接进行生物活性筛选与受体分子反应。其中与受体分子作用的树脂-多肽能够形成显色络合物，可以在显微镜下将它们分检出来。由于此法可以保证在同一个树脂株上合成的多肽是完全相同的，因此，筛选出来的树脂-多肽，用8mo1/L的盐酸胍将多肽与树脂分离后，可用微量多肽测序仪测出该肽的氨基酸顺序。这样，我们就能够从上百万个多肽异构体中，快速筛选出有希望的多肽。组合合成法与传统的合成方法相比较，最大的特点是可同时制备大量不同结构的多肽异构体，而且简化了百分之八十以上的操作步骤，是一个高效率低成本的理想合成法。