化学发光免疫标记分析技术(基本原理-)课件.ppt

1、免疫分析免疫分析u免疫反应： 抗原进入机体，刺激机体的免疫系统，使之产生免疫应答，这种反应叫免疫反应。免疫反应应答包括对抗原物质的感应、反应、效应三个连续的阶段。u 免疫分析（immunoassay，IA）： 在临床检验中，基于抗原与其配对抗体能够发生特异反应，用已知的抗原或抗体检测分析体液中的抗体或抗原性物质。 抗原抗体免疫反应特点抗原抗体免疫反应特点u高特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应的高特异性是免疫学检测的基础。u高亲和性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物

2、的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。 免疫学检测免疫学检测u免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：l抗原抗体的检测技术l免疫细胞的检测l细胞因子的检测l免疫相关基因分析l免疫标记技术免疫标记技术l免疫PCR(IM-PCR)技术 l杂交瘤技术与T细胞克隆技术放免放免酶免酶免发光发光60年代年代70年代年代90年代年代免疫分析标记技术的发展免疫分析标记技术的发展化学发光化学发光u化学发光：由于化学反应

3、（通常是氧化）底物从基态跃迁为激发态，激发态返回基态时，跃迁能量以光子形式释放的现象。吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱物质激发态物质激发态物质基态物质基态吸吸能能放放能能光谱产生过程基本原理光谱产生过程基本原理u化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。u美国临床化学会议规定：凡是通过测量光子计数的方法都是化学发光，包括通过酶促luminol发光。u化学发光免疫分析1980s进入体外诊断领域，第一台全自动检测仪1993年诞生。化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术待测样品待测样品标记抗体或抗原标记抗体或抗原洗涤去除未结合的反应物洗

4、涤去除未结合的反应物发光底物（或发发光底物（或发光剂）光剂）仪器检测仪器检测包包被抗体或抗原的被抗体或抗原的磁珠或反应管磁珠或反应管反应反应15-60分钟分钟反应反应0-5分钟分钟发光免疫分析基本操作步骤发光免疫分析基本操作步骤( (一步法一步法) ) 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Photon (425nm)ROHROH NSRBOHOH增强剂（Enhancer）鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物 鲁米诺化学发光系统鲁米诺化学发光系统CH3C=OORN+OH-H+H2O2+ H2O+ROH光子 +

5、 CO2 +CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO吖啶酯化学发光系统吖啶酯化学发光系统吖啶酯化学发光系统碱性磷酸酶及其衍生物的化学发光系统+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3 金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统碱性磷酸酶化学发光系统碱性磷酸酶化学发光系统化学发光按化学发光按化学反应类型分为：化学反应类型分为：u直接化学发光（非酶促化学发光）l吖啶酯系统l异鲁米诺系统u间接化学发光（酶促化学发光）l辣根过氧化物酶鲁米诺系统（HRP系统）l碱性磷酸酶金刚烷系统（AP系统）u其它l电化学发光化学发光的检测类

6、型化学发光的检测类型u直接化学发光直接化学发光：以化学物质,如异鲁米诺、吖啶酯等直接标记抗原或抗体，免疫反应后，直接引发化学发光反应进行检测。u 产品：产品：l吖吖啶酯标记啶酯标记 : 西门子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000l异异鲁米诺标记鲁米诺标记 ：索林DiaSoin Liaison 新产业直接化学发光直接化学发光u间接化学发光间接化学发光：用参与发光反应的酶来标记抗原或抗体，免疫反应后，加入发光底物，测定发光体系的发光强度来进行抗原或抗体的检测。两大反应体系：u辣根过氧化物酶（HRP）系统：氧化还原反应，稳定性差l源德、科美、安

7、图u碱性磷酸酶（AP）系统：水解反应，灵敏度较高l贝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800l西门子：Immulite1000 , Immulite 2000l达成生物：AULIN200间接化学发光间接化学发光以碱性磷酸酶系统为例u电化学发光：电化学发光：一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，直接由三联吡啶钌 Ru(bpy)32+ 标记抗体，反应时标记物直接发光。u 产品：产品：lRoche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601电化学发光电化学发光u第一代：鲁米诺及其衍生物u第二代：l直接标记：吖叮酯标记l间接标记：碱性磷酸酶

8、-金刚烷系统l电化学发光：三联砒啶钌化学发光的发展史化学发光的发展史国际主流免疫诊断公司均采用第二代化学发光标记物：吖啶酯（雅培、西门子）、碱性磷酸酶-金刚烷（贝克曼、西门子）、三联砒啶钌（罗氏）。化学发光按检测方式分为：化学发光按检测方式分为：u随机处理模式：管式化学发光（磁微粒分离）u批处理模式： 板式化学发光（物理吸附）化学发光的检测方式化学发光的检测方式u适合流行病调查、疾病预防与控制、体检中心，以及医院血站等大样本检测项目的使用（比如HIV、TP、HCV和乙肝两对半等）。u通常采用96孔白色不透明微孔板进行包被，不方便随到随测和医院急诊；u对于定量检测需要做标准曲线。国内厂家主要是板

9、式化学发光系统国内厂家主要是板式化学发光系统板式化学发光板式化学发光u采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；u可以随到随测，适用于医院急诊；u定量检测的标准曲线存储在试剂条形码中，可在2-4周内直接使用。国外厂家全部是管式化学发光系统国外厂家全部是管式化学发光系统管式化学发光管式化学发光磁微粒示意图磁微粒示意图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y磁微粒分离技术特点：l较微孔板扩大抗原抗体结合表面积，增加抗原或抗体的结合量，

10、提高检测灵敏度。l加快反应速度，迅速捕获抗原抗体。l易于结合相、游离相的分离，提高检测准确性。l提高发光强度，快速达到稳定发光。管式化学发光大多用磁微粒，板式化学发光使用微孔板载体。管式化学发光大多用磁微粒，板式化学发光使用微孔板载体。磁微粒分离技术磁微粒分离技术酶标酶标荧光荧光放免放免发光发光灵敏度灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9化学发光免疫分析技术的优越性化学发光免疫分析技术的优越性u灵敏度高灵敏度高：CLIA灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏50万倍。

11、几种标记几种标记/ /检测技术灵敏度的比较检测技术灵敏度的比较放免放免酶标酶标荧光荧光发光发光线性范围线性范围105104103102化学发光免疫分析技术的优越性化学发光免疫分析技术的优越性几种标记几种标记/ /检测技术线性范围的比较检测技术线性范围的比较u线性范围宽线性范围宽：发光强度在46个数量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于放射免疫分析技术。酶标酶标荧光荧光放免放免发光发光有效期（月）有效期（月）1815129630化学发光免疫分析技术的优越性化学发光免疫分析技术的优越性几种标记几种标记/ /检测试剂的有效期比较

12、检测试剂的有效期比较u试剂有效期长试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。u安全性好安全性好：彻底消除了放射性危害，环保、安全。到目前为止，还未发现CLIA的危害性。u光信号持续时间长光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定。u分析方法简便快速分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步法，容易实现自动化。u结果稳定、误差小

13、结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。化学发光免疫分析技术的优越性化学发光免疫分析技术的优越性u甲状腺激素甲状腺激素 u生殖激素生殖激素u肾上腺肾上腺/垂体激素垂体激素 u贫血因子贫血因子u肿瘤标志肿瘤标志 u感染性疾病感染性疾病化学发光免疫分析技术的应用化学发光免疫分析技术的应用u糖尿病糖尿病 u心血管系统心血管系统u病毒标志病毒标志 u骨代谢骨代谢u过敏性疾病过敏性疾病 u治疗药物监测治疗药物监测结论结论u 化学发光免疫技术是理想的体外诊断化学发光免疫技术是理想的体外诊断技术技术：l高灵敏性、特异性和稳定性l宽线性范围l使用范围广 l高通量和高度自动化l无放射性危险