1、a1A型口蹄疫液相阻断ELISA2015年12月a2一、液相阻断ELISA基础知识n液相阻断ELISA（LB-ELISA）通途：n1、检测口蹄疫感染，广泛用于国际贸易中，是OIE指定方法之一；n2、监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫效价，评价口蹄疫疫苗免疫效果。a3BL-ELISA原理图原理图待检血清与病待检血清与病毒抗原混合液毒抗原混合液捕获抗体捕获抗体检测抗体检测抗体病毒酶结合物病毒酶结合物显色液显色液阳性不显色阳性不显色阴性显黄色阴性显黄色a4nBL-ELISA反应原理：n将预先滴定好的病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了口蹄疫特异性抗体的ELISA
2、板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，再通过酶结合物与底物显色。按照实验孔呈现颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。n抗体滴度以阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。a5二、实验前准备二、实验前准备n1、使用前，试剂盒所有组份应回复到18-26，试剂要混合均匀，每个样品使用一个吸头。n2、浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。a6三、实验操作步骤三、实验操作步骤n1、抗原抗体反应布板a7图图 2 96 孔酶标板检测孔酶标板检测 20 份样品布局图份样品布局图S1 1:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:
3、1281:1281:2561:256S1 1:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512病毒抗原1:641:10241:1281:20481:2561:4096a8n1.1稀释病毒抗原：用配制好的洗涤液在孔外6倍稀释病毒抗原。n1.2待检血清稀释：在血清稀释板上，使用洗涤液连续2倍稀释每份被检血清，每份血清稀释2-8孔，根据检测用途而定。使每孔最终量都为50vl。n1.3稀释阳性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：16-1：1024。n1.4稀释阴性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：2-1：4。a9n1.5血清稀释板加样：使用稀释好的病毒抗原加样，其中预
4、设的4孔病毒抗原对照孔按100vl/孔加入，其余待检血清、阴阳性对照按50vl/孔加入。加样完毕，所有样品孔和因阳性对照孔稀释度翻倍，变为图1图、2所示。n1.6将加好样的血清稀释板封板，置于37反应2h。a10n2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从血清稀释板上按次序转移到包被板上50vl/孔，封板， 37反应30Min。n3、洗涤液洗版5次，拍干。加抗体溶液 50vl/孔，封板， 37反应35Min。n4、同上洗板5次，拍干。加酶结合物50vl/孔，封板， 37反应35Min。a11n5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底物溶液（显色液A和B按1：1混合），37 避光温育15min。n
5、6每孔再加50vl终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。a12a13四、结果分析四、结果分析n1、实验成立条件n病毒抗原对照OD值应在2.01范围内。n阳性对照抗体效价应在1：10241滴度范围内。n阴性对照抗体效价应1：8.n如果实验无效，实验中的操作值得怀疑，最好重新作一遍。a14n2、结果判定n抗原对照4孔，弃去1个最高和最低值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD450值。n备检血清OD450值临界值，判为阴性；n备检血清OD450值临界值，判为阳性；a15n每份血清系列滴度稀释中，阳性孔的最高稀释倍数即为该备检血
6、清的抗体效价。n若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如果处在1：64和1:128之间，则该份血清抗体效价是1：90。n定性检测时，两个孔只有一个孔为阳性，则抗体滴度为1：128，2孔均为阳性，则抗体效价1：128.a16n抗体效价1：128，判为阳性；n抗体效价1：64，判为阴性；n抗体效价在1：64- 1：128之间，判为可疑；可以血清需要复检，复检抗体效价1：128，判为阳性；抗体效价1：64，判为阴性；a17五、注意事项n1、实验前必须认真阅读说明书。n2、试剂盒所有浓缩试剂在低温放置下，可能有无机盐结晶，如果有结晶盐出现，80温育30min可溶解，且不影响实验。n3、所有试剂必须回复室温使用，以免影响抗原抗体反应a18n4、温育设备要精确度要高，温度过高过低都会影响OD值高低。n5、包被板反应时严禁堆叠放置，应平铺且板间有间隙，切不可离箱壁太近。n6、所用移液器和设备要精准。n7、备检样品要合格。a19操作要点操作要点n严谨的设计，优质的试剂，正确的操作严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证和良好的仪器是保证ELISA必要条件。必要条件。n严格遵照规定操作，必能得出准确的结严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。果。a20
