荧光光谱分析方法及原理课件.ppt

1、 某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物矿物 萤石萤石( (fluospar) )而得名。而得名。我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。光。除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、光如红外光、

2、X X射线也可能激发出荧光，因此除紫外射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X X射线荧光等。射线荧光等。In discussing absorption we have been concerned entirely with the excitation of a molecule from its ground state to a higher energy level and have given no consideration to the subsequent fate of the excited molecule.

3、In many cases the sequel is not very interesting; the energy is transferred as heat to the surroundings. In some cases light is emitted by the sample either as fluorescence or phosphorescence. We will discuss the general characteristics of emission and ignore the exceptions.Barak and Webb demonstrat

4、ed that as few as 30 fluorescent dye molecules bound to low density lipoprotein molecules can be detected on cell surfaces by microscopy using a sensitive video camera. With even more sophisticated methods others have moved toward detection of single fluorophore molecules in a laser-excited flow str

5、eam. Because this sensitivity can combine with ease of use and the potential for multiparameter analysis, fluorescence has become widely used in biology and medicine. Fluorescence is a sensitive technique for detecting biological materials荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命

6、、荧光偏振度等。强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外荧光光谱还可以检测一些紫外- -可见吸收光谱检测不到的时间可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级( (大约大约1010-15-15秒秒) )，但，但两个过程中有一个时间延搁，大约为两个过程中有一个时间延搁，大约为1010-8-8秒，这段时间内分子秒

7、，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的收的1010-15-15秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外可秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外可见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。 荧光光谱第二个特点是荧光光谱第二个特点是信息量较大信息量较大E

8、mission lifetimes of absorption, fluorescence, and phosphorescence at the equilibrium internuclear distance of the ground state.Diagram of a simple fluorescence instrumentFilter FluorometersInstruments in which wavelength selection is accomplished with filters are generally referred to as fluoromete

9、rs, whereas monochromator-based instruments capable of spectral scanning are called spectrofluorometers. The simplest, least expensive, fluorometers are single beam filter instruments with halogen lamp sources, phototube or PMT detectors and simple output devices. Ratiometric fluorometers are also a

10、vailable in which the ratio of the sample signal to a reference signal is used in order to compensate for fluctuations in fine voltage, drift, etc. In some instruments, such as the one shown in figure, the sample and reference light paths are taken from the same source and alternately measured by th

11、e same detector through the use of a mechanical cam. A similar configuration in which two detectors are used, one for the sample beam and one for the reference beam, will correct for source output fluctuations only. Single detector configurations are also possible to minimize effects of detector var

12、iability. Schematic diagram of a double-beam (ratiometric) filter fluorometer. Filter fluorometers are suitable for quantitative analysis applications in which spectral scanning and high resolution are not required. Filters transmit more light and cost less than monochromators, thereby providing bet

13、ter detection limits with less expensive instrumentation.Spectrofluorometers Spectrofluorometers are also available in both single beam and ratiometric configurations. A single beam instrument is shown in Figure 8. A ratiometric spectrofluorometcr configuration in which two separate detectors are em

14、ployed is depicted in Figure 9. The reference PMT monitors the excitation beam after it has passed through the monochromator so that corrections are based on fluctuations in the wavelength of interest only. The reference PMT is placed after the sample to monitor the transmitted beam, thereby allowin

15、g absorption measurements to be made on the sample.Figure 8 Schematic diagram of a single-beam spectrofluorometer. From Perkin-Elmer. Figure 9. Schematic diagram of a ratiometric spectrofluorometer. Single photon counting instruments are used to measure very low light levels and are designed for max

16、imum signal-to-noise performance. Figure 10. Depiction of single photon counting. The signal is detected by the PMT, emerging as a pulse which is then amplified. If the magnitude of the amplified pulse exceeds a certain threshold, it is passed through the discriminator and counted as a signal. Small

17、er pulses due to noise and dark current are much more likely to be rejected, thereby increasing signal-to-noise. Spectrofluorometers offer the most flexibility for quantitative and qualitative applications. Many instruments are modular so that monochromators can be replaced with filters in the emiss

18、ion or excitation beams if desired.主要譜参量激发谱和发射谱激发谱和发射谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。的光成

19、分的相对强度。 既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关关系。收谱极为相似，呈正相关关系。激发谱和吸收谱的关系激发谱和吸收谱的关系由于激发态和基态有相似的振由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级一

20、电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。呈镜象对称关系。 吸收谱与发射谱的关系吸收谱与发射谱的关系在发射谱中最大荧光强度的位置称为在发射谱中最大荧光强度的位置称为 maxmax，它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感。极性和荧光团的运动很敏感。 荧光寿命荧光寿命(fluorescence lifetime) 去掉激发光后，分子的荧光强度降到去掉激发光去掉激发光后，分子的荧光强度降到去掉激发光时荧光强度时荧光强度I0的的1/e所需要的时

21、间，称为荧光寿命所需要的时间，称为荧光寿命，常用，常用 表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律规律:It I 0e-kt 其中其中I0是激发时最大荧光强度，是激发时最大荧光强度，It是时间是时间t时的荧时的荧光强度，光强度，k是衰减常数。假定在时间是衰减常数。假定在时间 时测得的时测得的It为为I0的的1/e，则，则 是我们定义的荧光寿命。是我们定义的荧光寿命。寿命寿命 是衰减常数是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规

22、律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需所需的时间都应等于的时间都应等于 。 如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比，荧光发射速光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比，荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数，因此有率即为单位时间中发射的光子数，因此有 F 1/KF。KF是发射速率衰减常数。是发射速率衰减常数。 F表示荧光分子的固有荧光寿命，表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射速表示荧光发射速率的衰减常数。率的衰减常数。处于激发态的分子，除了通过

23、发射荧光回到基态以外，处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程还会通过一些其它过程( (如淬灭和能量转移如淬灭和能量转移) )回到基态，回到基态，其结果是加快了激发态分子回到基态的过程其结果是加快了激发态分子回到基态的过程( (或称退激过或称退激过程程) )，结果是荧光寿命降低。，结果是荧光寿命降低。寿命寿命 和这些过程的速率常数有关，总的退激过程的速率和这些过程的速率常数有关，总的退激过程的速率常数常数k k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示可以用各种退激过程的速率常数之和来表示: :k kF+ kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。表示各种非辐射过程的衰

24、减速率常数。则总的寿命则总的寿命 为为: 1/k 1/(kF+ ki)由于吸收几率与发射几率有关，由于吸收几率与发射几率有关， F与摩尔消光系数与摩尔消光系数 max (单位为单位为cm2mol-1或或 (mol dm-3) -1cm-1)也密切相也密切相关。关。从下式可以得到从下式可以得到 F的粗略估计值的粗略估计值(单位为秒单位为秒)。1/ F104 max在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。子在某种特定状态下存在的时

25、间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。面的信息。量子产率量子产率 (quantum yield) 荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的效率。表示物质发射荧光的效率。荧光量子产率通常用荧光量子产率通常用 来表示，定义为发射量子数和吸收来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。子中所占的比例，又称为荧光效率。 发射量子数发射量子数 吸收量子

26、数吸收量子数 的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。后面将要证明后面将要证明: :对稀溶液来说，荧光强度对稀溶液来说，荧光强度F F与吸收度与吸收度A A成正成正比比: :F kI0A 这里这里k是比例常数，是比例常数，I0是吸收前的光强度，是吸收前的光强度， 是荧光量子是荧光量子产率。产率。若两种溶液测量条件完全相同，则它们的若两种溶液测量条件完全相同，则它

27、们的k和和I0相同相同:F1/F2 A1 1/(A2 2) 1/ 2 F1A2/(F2A1)已知已知 2就可求出就可求出 1。Figure 11.13 The relative fluorescence yield is defined for a single wavelength and depends on the wavelength chosen for observation.由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭称为淬灭( (quenching) )，如温度淬灭、杂质淬灭等，如温度淬灭、杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的

28、环境以及各种淬灭过。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果只需要研究量子产率的相对值，改变。因此，如果只需要研究量子产率的相对值，则只要量测荧光强度也就足够了。则只要量测荧光强度也就足够了。荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度F取决于激发态的初始分布取决于激发态的初始分布IA与量子产率与量子产率 的的乘积。乘积。这里的这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此

29、仪器测到的荧光强度测到的荧光强度 IA Z，这里，这里Z是仪器因子。是仪器因子。椐据椐据Beer-Lambert定律可以推得：定律可以推得：F=2.3I0 ( A)CL Z式中式中 ( A)为激发波长为激发波长 A处的消光系数，处的消光系数，为样品分子为样品分子的浓度，的浓度，I0为入射光强度，为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，为透过样品后的光强度，L为光程（样品池光径）为光程（样品池光径）如果激发光强保持不变，且如果激发光强保持不变，且 和和Z与激发波长无关，则与激发波长无关，则F ( A)很显然，荧光强度与样品在波度很显然，荧光强度与样品在波度 A处的消光系数有关处的消光系数有关，而

30、消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。而变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。当然，实际上仪器因子当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。发谱与吸收谱并不完全相似。荧光偏振荧光偏振（偏振荧光，极化荧光）（偏振荧光，极化荧光） 用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，可以产生极化荧光。可以通过对极化荧光的分析可

31、以产生极化荧光。可以通过对极化荧光的分析确定分子的大小、形状和流动性等性质。因此极确定分子的大小、形状和流动性等性质。因此极化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段。 荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质。溶液中分子偶极矩方向的分布是随光这样一种性质。溶液中分子偶极矩方向的分布是随机的，为什么用偏振光激发时产生的荧光是偏振光呢机的，为什么用偏振光激发时产生的荧光是偏振光呢？从经典物理的观点来看，电子的跃迁相应于一个电？从经典物理的观点来看，电子的跃迁相应于一个电偶极子的振动，其振动方向和电场变

32、化方向一致时被偶极子的振动，其振动方向和电场变化方向一致时被激发发的几率最大，并随两者间夹角余弦的平方（激发发的几率最大，并随两者间夹角余弦的平方（COSCOS2 2 ）而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子）而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子方向垂直的方向上最强（即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的方向上最强（即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的荧光最强），在与电偶极子平行的方向上方向垂直的荧光最强），在与电偶极子平行的方向上最弱。最弱。溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸收到发溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸收到发射的时间之内，分子本身已经产生了转动，因此荧射的时间之内，分子本身已

33、经产生了转动，因此荧光偏振的程度将减小，所以荧光偏振又常称为荧光光偏振的程度将减小，所以荧光偏振又常称为荧光消偏振或荧光去偏振。消偏振或荧光去偏振。在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中，在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中，的值称为本征极化率的值称为本征极化率P0。如果分子在激发态的寿。如果分子在激发态的寿命期间有一定的运动，则的值可能与命期间有一定的运动，则的值可能与P0不等。不等。T-format for polarization measurements. DET, detector; G, gain. S u b s c r i p t s r e f e r t o ho

34、rizontal (H), vertical (V), perpendicular( ) and parallel( ). 图图 荧光偏振测量荧光偏振测量如图所示，假设沿如图所示，假设沿z轴振动的轴振动的平面极化光由平面极化光由x轴入射原点，轴入射原点，在原点有荧光分子，受其激发在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在后此分子发射极化荧光，在y轴收集极化荧光，轴收集极化荧光，令令I I为沿为沿轴振动的极化荧光，令轴振动的极化荧光，令I I 为为沿轴振动的极化荧光。沿轴振动的极化荧光。 如图所示，假设沿如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由轴振动的平面极化光由x轴入射原点轴入射原点，在

35、原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在在y轴收集极化荧光，令轴收集极化荧光，令I为沿轴振动的极化荧光，令为沿轴振动的极化荧光，令I 为沿轴振动的极化荧光。为沿轴振动的极化荧光。定义极化率定义极化率(或偏振度或偏振度)P P (I(II I )/(I)/(I+I+I ) ) (I(IVVVVI IVHVH)/(I)/(IVVVV+I+IVHVH) )下标中的前、后两个字母分别表示入射光和发射光的偏下标中的前、后两个字母分别表示入射光和发射光的偏振方向，振方向，V(vertical)表示垂直，表示垂直，H(horizontal)表示水平，表

36、示水平，如其中如其中IVH是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度，其它如得的荧光强度，其它如IVV也依此类推也依此类推。 由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正因子正因子G G，定义，定义G G为水平偏振光激发样品时，仪器对垂为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，为为G IHV/IHH IHV为起偏器水平取向而

37、检偏器垂直取向时测得的荧为起偏器水平取向而检偏器垂直取向时测得的荧光强度，光强度，IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度。仪器不同，波长不同，值都可能不同，荧光强度。仪器不同，波长不同，值都可能不同，应分别测定。应分别测定。经校正后的荧光偏振度经校正后的荧光偏振度 (IVV GIVH)/(IVV+GIVH)定义定义不对称度不对称度(或荧光或荧光各向异性，各向异性，anisotropy factor) A (I I )/(I+2I )(I+2I )表示发射光的全部，包括平行于入射光表示发射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方

38、向上的分方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。量。 经校正后的不对称度经校正后的不对称度A (IVV GIVH)/(IVV+2GIVH)iiiavgrFrP P和和A A的量测有时在稳态条件下进行，即采的量测有时在稳态条件下进行，即采用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的偏振光脉冲来测量偏振光脉冲来测量I I和和I I 的时间函数。这的时间函数。这种技术常能测到一些其他的运动，是一种种技术常能测到一些其他的运动，是一种时间分辨的技术。时间分辨的技术。 荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分析的灵敏度

39、要比吸收光谱测量高析的灵敏度要比吸收光谱测量高23个数量级。但正个数量级。但正因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如样品的温度度、如样品的温度度、pH值以及样品中杂质的存在等等。值以及样品中杂质的存在等等。有时，为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考有时，为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑和设法减少这些因素的影响；有时，也可巧妙地利用虑和设法减少这些因素的影响；有时，也可巧妙地利用荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。 下面，我们将分别列举一些环境因素对下面，我们将分别列

40、举一些环境因素对 max、 F和和 F 等荧光参数的影响。等荧光参数的影响。溶剂影响的结果可以用溶剂影响的结果可以用Lippert方程来描述：方程来描述： 常数常数 其中，其中， a与与 f分别为荧光分子的吸收波数与发射分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，波数， af 反映了吸收光与发射光能量的差别；反映了吸收光与发射光能量的差别； 为溶剂的介电常数；为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；为普朗克常数；c为光速，为光速，a为荧光分子在溶剂中的半径，为荧光分子在溶剂中的半径， 与与 分别为荧光分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。分子处于基态和激发态时的偶极矩。32*22)(1211212ann

41、hcfa由上式可见，介电常数增加会使能量差增大，而折射率增加由上式可见，介电常数增加会使能量差增大，而折射率增加使能量差减少。由于荧光分子激发态的偶极矩使能量差减少。由于荧光分子激发态的偶极矩 一般要大于一般要大于基态偶极矩基态偶极矩 ，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数 不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，上式中第一不仅与偶极子取向有关，也

42、与电子取向有关，上式中第一项项()/(2)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n n与与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。果。由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，子的作用下偶极子重新取向的问题， n2， af很小。而很小。而在极性溶剂中在极性溶剂中 af 较大，产生红移。较大，产生红移。The hydrogen bonding reaction of 2-AN with ethanol

43、The fluorescence of 2-AN is shown in cyclohexane to which ethanol was added at 0% (), 0.2% (.), 0.4% ( ), 0.7% ( ), l.7% ( ), and 2.7% ( ).环境因素对环境因素对 max的影响的影响 一般来说，处于第一电子激发态的分子，其电一般来说，处于第一电子激发态的分子，其电荷分布与它处于基态时是不同的。生色团与周围荷分布与它处于基态时是不同的。生色团与周围溶剂分子的相互作用可能会先于发射而发生，这溶剂分子的相互作用可能会先于发射而发生，这种相互作用会改变激发态的能量及荧

44、光发射的频种相互作用会改变激发态的能量及荧光发射的频率。引起每个电子能级中最低振动能级之间的吸率。引起每个电子能级中最低振动能级之间的吸收和发射跃迁（即收和发射跃迁（即0-00-0跃迁）的不平衡，并会破跃迁）的不平衡，并会破坏镜象关系。坏镜象关系。 同一种荧光物质在不同极性的环境中同一种荧光物质在不同极性的环境中，其，其 max 可能会有所差别。一般来说可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极

45、子重子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移。例如，的能量，引起发射谱的红移。例如，当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙醇到辛醇依次减小时，醇到辛醇依次减小时，ANS（1-1-氨基氨基- -8-8-萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生兰移，量子产率提高。兰移，量子产率提高。 环境环境(如溶剂如溶剂)的极性对的极性对 max的影响的影响 上

46、面提到的上面提到的“环境极性加强，环境极性加强， max红移红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态的寿命之内，分子没有足够的时间激发态的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生发生 m a x兰移的情况。这种现象称为兰移的情况。这种现象称为“orientation constraint”。因此在利用。因此在利用 max作为环境极性的探针时要十分谨慎。作为环境极性的探针时要十分谨慎。 pHpH值对值对 max的影响的影响如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pHpH

47、值的改变值的改变常对常对 maxmax有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光离子在电子结构上有所不同，因而荧光 maxmax也可也可能发生变化。例如，能发生变化。例如，1-1-萘胺萘胺-5-5-磺酸在不同磺酸在不同pHpH值值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其荧光波长作为荧光波长作为pHpH值的指示剂。值的指示剂。 溶液粘度对溶液粘度对 max的影响的影响溶液粘度有时也会对溶液粘度有时也会对 max

48、max有影响，例如荧光有影响，例如荧光探针探针TNSTNS在蔗糖水溶液中的在蔗糖水溶液中的 maxmax会随蔗糖浓会随蔗糖浓度的变化而变化。当蔗糖浓度由度的变化而变化。当蔗糖浓度由10%10%增加到增加到60%60%，粘度从，粘度从1.31.3分泊增加到分泊增加到5858分泊，分泊， maxmax从从580 nm580 nm兰移到兰移到555 nm555 nm。 共振能量转移对共振能量转移对 max的影响的影响如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸收的光激发使之处够接近时，用一种生色团能吸收的光激发使之处于激发态后，处于激

49、发态的这种生色团可能将激于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对 maxmax可能造成影响。可能造成影响。 环境对荧光量子产率环境对荧光量子产率 F和和荧光强度的影响荧光强度的影响由于稀溶液中荧光强度由于稀溶液中荧光强度F K I0 A F （这（这里里I I0 0是激发光强度，是激发光强度，A A是光密度或吸收度，是光密度或吸收度， 0 0是荧光

50、量子产率，是荧光量子产率，K K为常数）为常数） ，因此凡，因此凡是会影响荧光量子产率是会影响荧光量子产率 F F的环境因素也必的环境因素也必然会影响荧光强度。然会影响荧光强度。 溶剂（或环境）极性的影响溶剂（或环境）极性的影响量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。这一点前面已经境）极性的减小而增加。这一点前面已经提到过。一种可能的机制是：在非极性的提到过。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。的速率会减少。 光化分解光化分解荧光物质因吸收光能而造成某一键断裂的荧