蛋白质工程及其在食品工业中的应用课件.ppt

1、酶酶.几乎全都是蛋白质。几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中的染色体移动肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中的染色体移动.高等生物的有序生长和分化过程。高等生物的有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒的能力。备抵抗各种细菌、真菌和病毒的能力。由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，负责神经冲动的由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，负责神经冲动的形成和传导。形成和传导。血红蛋白具有结合和释放氧的能力，是血液中氧、二血红蛋白具有结合和释放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携带者。氧化碳和氢离

2、子的携带者。另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成的。纤蛋白单体聚合而成的。1.1.催化功能：催化功能：酶酶2.2.调节功能：调节功能：激素激素3.3.结构功能：结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.4.运输功能：运输功能：血红蛋白血红蛋白5.5.免疫功能：免疫功能：免疫球蛋白免疫球蛋白6.6.运动功能：运动功能：鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白7.7.储藏功能：储藏功能：酪蛋白酪蛋白8.8.生物膜功能：生物膜功能：及神经传导等及神经传导等 蛋白质是蛋白质是生命生命的体现者，离开了蛋白质，生命将的体现者

3、，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由由于蛋白质是由许多许多氨基酸氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体而氨基酸是由三联体密码决定的，只要密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。碱基就能达到改造蛋白

4、质的目的。蛋白质工程的一蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。更符合人类的需要。一、蛋白质工程的崛起的缘由一、蛋白质工程的崛起的缘由1 1、基因工程产物、基因工程产物 基因工程在原则上只能生产基因工程在原则上只能生产自然界已自然界已存在的存在的蛋白质。蛋白质。 这些这些天然蛋白质天然蛋白质是生物在长期进化过是生物在长期进化过程中形成的程中形成的, ,它们的结构和功能符合特定它们的结构和功能符合特定物种生存的需要物种生存的需要,

5、 ,却却不一定完全符合人类不一定完全符合人类生产和生活的需要。生产和生活的需要。实例实例1 1：玉米中赖氨酸的含量比较低：玉米中赖氨酸的含量比较低 如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶进行改造进行改造, ,可以使玉米叶片和种子中的游离可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高赖氨酸分别提高5 5倍和倍和2 2倍。倍。 原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响。当的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响。当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两赖氨酸浓

6、度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性。种酶的活性。实例实例2:2:工业用酶工业用酶在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活在这种条件下，大多数

7、酶会很快变性失活。提高蛋白。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，来说，提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。 你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？什么关系？我国科学家承担了什么任务？ 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之人类蛋白质组计划是继人类

8、基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。科学命题。20012001年，国际人类蛋白质组组织年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由项重大国际合作行动：一项是由中国科学家中国科学家牵头执行的牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”；另；另一项是以美国科学家牵头执行的一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆人类血浆蛋白质组计划蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋

9、白质组计划”是国际上第一个是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有目前有1616个国家和地区的个国家和地区的8080多个实验室报名多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将人类蛋白质组

10、计划的深入研究将是对蛋白质是对蛋白质工程的有力推动和理论支持工程的有力推动和理论支持。 思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？应该应该从对基因的操作来实现从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，对天然蛋白质改造，主要原因如下：主要原因如下：（1 1）任何一种天然蛋白质都是由）任何一种天然蛋白质都是由基因基因编码的，编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过改造过的蛋白质可以遗传下去的蛋白质可以遗传下去。如果对

11、蛋白质直接改造，如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。遗传的。（2 2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容容易操作，难度要小得多易操作，难度要小得多。 1 1、蛋白质工程的目标、蛋白质工程的目标 根据人们对根据人们对蛋白质功能蛋白质功能的特定需求，的特定需求，对蛋白质的对蛋白质的结构结构进行分子设计。进行分子设计。2 2、天然蛋白质的合成过程天然蛋白质的合成过程DNADNA（基因）（基因）转录转录mRNAmRNA翻译翻译蛋白质蛋白质基因基因表达（转录和翻译）表达（转录和翻译）形成氨

12、基酸序列的多形成氨基酸序列的多肽链肽链形成具有高级结构的蛋白质形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能行使生物功能 复制复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。 转录转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。 翻译翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。 中心法则中心法则：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质的流动途径。 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA中心法则中心法则：遗传信息由DNA

13、 mRNA 蛋白质的流动途径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO的合成。 B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。 、蛋白质工程的基本途径蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）（基因）讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸丙氨酸色氨酸色氨酸赖氨酸赖氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸（1 1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？）怎样得出决定这一段肽

14、链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。请把相应的碱基序列写出来。首先应该根据三联密码子推出首先应该根据三联密码子推出mRNAmRNA序列，序列，每种氨基每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复联密码子编码，因此其碱基排列组合起来

15、就比较复杂，至少可以排列出杂，至少可以排列出1616种种。密码子：密码子：UCAUG A UUAmRNA密码子密码子密码子密码子密码子密码子mRNAmRNA上决定一个氨基酸的三个相邻碱基上决定一个氨基酸的三个相邻碱基密码子总数：密码子总数：4 43 3=64=64种种( (其中其中6161种密码子是对应氨基酸种密码子是对应氨基酸 和起始；另有和起始；另有3 3个不对应氨基酸，只对应终止个不对应氨基酸，只对应终止) )1 1种密码子只对应种密码子只对应1 1种氨基酸；种氨基酸；1 1种氨基酸可以对应多种密码子。种氨基酸可以对应多种密码子。 密码子在生物界基本是是通用的。这也是生物密码子在生物界基

16、本是是通用的。这也是生物彼此间存在亲缘关系的证据之一彼此间存在亲缘关系的证据之一 。GCUGCU（或（或C C或或A A或或G G）UGGAAAUGGAAA（或（或G G）AUGUUUAUGUUU（或（或C C） mRNAmRNA序列序列 脱氧核苷酸脱氧核苷酸序列序列GCT (GCT (或或C C或或A A或或G) TGGAAA (G) TGGAAA (或或G)ATGTTT (G)ATGTTT (或或C)C)CGA (CGA (或或G G或或T T或或C) ACCTTTC) ACCTTT（或（或C)TACAAA (C)TACAAA (或或G)G)（2 2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才）确定

17、目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（能合成或改造目的基因（DNADNA）？）？确定目的基因的碱基序列后，就可以根据确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人类的需要改造它，通过人工合成的方法人工合成的方法或从基因库中获取。或从基因库中获取。蛋白质工程就是以蛋白质的结构与功能为基础，利蛋白质工程就是以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。具有优良特性的蛋白质分子。

18、u蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念19831983年，美国生物学家额尔默首先提出了年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据的概念。蛋白质工程的实践依据DNADNA指导合成蛋白质，因指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。的要求。 蛋白质工程是指通过生物技术手段对蛋白质的分子蛋白质工程是指通过生物技术手段对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造，以便获的更结构或者对编码

19、蛋白质的基因进行改造，以便获的更适合人类需要的蛋白质产品的技术。适合人类需要的蛋白质产品的技术。 蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质物理和化学等各方面动力学的研究，获取有关蛋白质物理和化学等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNADNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程。生产条件的全新

20、蛋白质的过程。 5 5、蛋白质工程与基因工程的关系、蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白质工程是在基因工程的基础上蛋白质工程是在基因工程的基础上，延，延伸出来的伸出来的第二代基因工程第二代基因工程，是包含多学科，是包含多学科的综合科技工程领域。的综合科技工程领域。 基因工程基因工程是通过基因操作把外源基因转是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，入适当的生物体内，并在其中进行表达，它它的产品是的产品是该基因编码的该基因编码的天然存在的蛋白天然存在的蛋白质质。 蛋白质工程蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照

21、人类自身的间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。 蛋白质工程自诞生之日起，就蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可与基因工程密不可分分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改

22、造的、具有了人类所需要的的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。优点的蛋白质。 通常所说的通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋蛋白质工程白质工程的发展，其的

23、发展，其成果也会应用到酶工程中，成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分使酶工程成为蛋白质工程的一部分。 肽键就是由氨基酸的肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的氨基脱水缩合而形成的化学键化学键肽肽: :氨基酸通过肽键连结起来的化合物氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽二肽: :两个氨基酸形成的肽两个氨基酸形成的肽三肽三肽: :三个氨基酸形成的肽三个氨基酸形成的肽多肽多肽: :许多氨基酸形成的肽许多氨基酸形成的肽蛋白质蛋白质: :大多为大多为100100个以上氨基酸组成的多肽个以上氨基酸组成的多肽氨基酸残基氨基酸残基: :多肽链中多肽链中

24、不完全不完全的氨基酸。的氨基酸。氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。此表现出其分子的不完整。氨基末端：氨基末端：多肽链中含有自由多肽链中含有自由-氨基的一氨基的一端。端。简称简称N-N-端端羧基末端：羧基末端：多肽链中含有自由多肽链中含有自由-羧基的一羧基的一端。端。 简称简称C-C-端端蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的

25、组成和排每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构白质的二级、三级等高级结构 。蛋白质分子的一级结构蛋白质分子的一级结构 A链链 Gly.Tle.Val.Glu.Gln.Cys.Cys.Aln.Ser.Val.Cys.Ser.Leu.Tyr.Gln.Leu.Glu.Asn.Tyr.Cys.Asn OH 1 2 6 7 11 20 B链链Phe.Val.Asn.Gln.His.Leu.

26、Cys.Gly.Ser.His.Leu.Val.Glu.Ala.Leu.Tyr.Leu.Val.Cys.Gly.Glu.Arg. 1 2 7 19 Gly.Phe.Phe.Tyr.Thr.Pro.Lys.Ala OH 30 牛牛胰胰岛岛素素的的化化学学结结构构SSSSSS牛牛胰胰岛岛素素的的一一级级结结构构1 1（1 1）氢键：）氢键：氢原子与负电性强的原子氢原子与负电性强的原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象的维护很重要。维构象的维护很重要。（2 2）静电引力）静电引力：正负带电基团之间的吸正负带电基团之间的吸引力。对蛋白质分子三维构象的稳定引力

27、。对蛋白质分子三维构象的稳定贡献贡献不是很大不是很大，也称为离子键或盐键，也称为离子键或盐键（3 3）范德华力：）范德华力：原子团相互接近时诱导原子团相互接近时诱导所致。它变化多样，对维持蛋白质活性中所致。它变化多样，对维持蛋白质活性中心的构象心的构象影响很大影响很大维持蛋白质空间结构的化学键维持蛋白质空间结构的化学键（4 4）疏水相互作用）疏水相互作用：是非极性基团为了是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的作用是维持蛋白质高级结构的重要因素重要因素（5 5）二硫键：）二硫键：作用很强，对稳定蛋白质作用很强，对稳定蛋白质构

28、象起重要作用构象起重要作用氢键、离子键、疏水作用和范德华力氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键等次级键是非共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键键蛋白质二级结构蛋白质二级结构 二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象）结构（构象）主要形式：主要形式：-螺旋螺旋、-折叠折叠、 - -转角转角、无规卷曲无规卷曲等等-转角转角蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构 螺旋螺旋折折叠片叠片转角转角自由自由回转回转三级结

29、构三级结构三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上进一步盘进一步盘曲而成特定格式的三级结构。曲而成特定格式的三级结构。四级结构四级结构很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。结构的多肽链组成的。这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚

30、基多无生物学活性，具有完整四级链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。结构的蛋白质分子才有生物活性。血红蛋白中四亚基两两相同，血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为分别称为1 、2、1、2蛋白质工程主要包括蛋白质工程主要包括4大类研究大类研究：第一，利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用第一，利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。第二，定量确定蛋白质结构研究。第二，定量确定蛋白质结构- -功能关系。这是功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定构模型的

31、建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等性研究等. .第三，从混杂变异体库中筛选具有特定结构第三，从混杂变异体库中筛选具有特定结构- -功能关功能关系的蛋白质。系的蛋白质。第四，根据已知结构第四，根据已知结构- -功能关系的蛋白质，用人工方功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体法合成它及其变异体. . (4)(4)围绕这些关键的基团和结构提出对蛋围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。方法去实施。 (5)(5)对经过改造的蛋白质进行功能性测定对经过改造的蛋白质进行功能性测定. .二、蛋白质工程的改造策略二、蛋白质

32、工程的改造策略1 1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；螺旋和螺旋和折叠区折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。带电荷区域通常位于蛋白质的表面。2 2、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。应尽量保留保守残基。 3 3、应注意保

33、留潜在的、应注意保留潜在的N N糖基化位点糖基化位点(Asn-X-Ser(Asn-X-SerThr-Thr-X-Pro)X-Pro)中的中的Asn(Asn(天门冬酰胺天门冬酰胺) )、Set(Set(丝氨酸丝氨酸) )或或Thr(Thr(苏苏氨酸氨酸) )。 4 4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。正确折叠。 5 5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽

34、量使其接合部、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。于所预测结构的边缘。 6 6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋

35、白质整体功能的破坏要轻。比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。7 7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。性酶切位点进行删除。 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：模和程度可以分为：初级改造：初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入删除、置换或插入高级改造高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质从头设计合成新型蛋白质 一、一、 初级改造初

36、级改造 通过通过基因突变方法基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。质的目的。 目前，主要采用的基因突变方法：目前，主要采用的基因突变方法：l基因定位突变基因定位突变l盒式突变盒式突变。 基因定位突变基因定位突变根据三联体密码，编码根据三联体密码，编码DNADNA（目的基因）的确定位点，（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。成出具有预期氨基酸序列的修

37、饰蛋白质。这种通过造成一个或几个碱基这种通过造成一个或几个碱基定点突变定点突变，以达到修饰，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。基因定位突变的基本过程基因定位突变的基本过程：首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统( (如大肠杆菌等如大肠杆菌等) )即可产生突变体蛋白质。这是目前定即可产生突变体蛋白

38、质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。向改造蛋白质的基本手段。 （一）（一）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术寡聚核苷酸介导诱变技术 特点：特点：能够准确按照人们的意图进行能够准确按照人们的意图进行DNADNA突变，即想改突变，即想改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变基本过程：基本过程：将待研究的基因插入载体将待研究的基因插入载体M13M13，制得单链模，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4T4连接酶连接酶

39、连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。变型蛋白质。（二）（二） 寡核苷酸介导的寡核苷酸介导的PCR诱变技术诱变技术 特点：特点：利用利用PCRPCR技术定点诱变，可使突变体大技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率量扩增，提高诱变率 以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物

40、，直接（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。 过程：过程：l将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特定的每管各加入两个特定的PCRPCR引物，一个引物与基因内部引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但

41、有一个核苷酸发生了突变；互补，但有一个核苷酸发生了突变；l两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以同，所以PCRPCR扩增后，产物有不同的末端。扩增后，产物有不同的末端。l将两管将两管PCRPCR产物混合、变性、复性，则每条链会与另一产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状管中的互补链退火，形成有两个切口的环状DNADNA，转入，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被修复。若同一管子中的大肠杆菌后，这两个切口均

42、可被修复。若同一管子中的两条两条DNADNA链结合，会形成线性链结合，会形成线性DNADNA分子，它不能在大肠杆分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，只有环状菌中稳定存在，只有环状DNADNA才能在大肠杆菌中稳定存才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。 （三）随机诱变技术（三）随机诱变技术 （四）盒式突变技术（四）盒式突变技术 l常用方法：将基因克隆到质粒上，旁边有两个紧常用方法：将基因克隆到质粒上，旁边有两个紧密相连的限制性内切酶位点，双酶解后产生一个密相连的限制性内切酶位点，双酶解后产生一个33凹陷的末端和一个凹陷的末端和一个55

43、凹陷的末端，与克隆基因凹陷的末端，与克隆基因想邻的末端是想邻的末端是33凹陷和凹陷和55凹陷。凹陷。 l19851985年年WellsWells提出的一种基因修饰技术，可经过一提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生次修饰，在一个位点上产生2020种不同氨基酸的突变种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱饱和性和性”分析。分析。 利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的载体和基因上没有的，用该内切酶消化基，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化

44、的双链因，再用合成的发生不同变化的双链DNADNA片段替代被消片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。 二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接） 研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即构层次，即结构域结构域结构域由结构域由螺旋、螺旋、折叠等二级结构单位按一定的折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。拓扑学规则构成的三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结

45、构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。种蛋白的性质。 三、全新蛋白质的设计与构建三、全新蛋白质的设计与构建 上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。构，以期达到改变其性质的

46、目的。如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。某种具有特定功能的人工蛋白质分子。 蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。良好的应用前景。 提高蛋白的稳定性包括以下几个方面提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：延长酶的半衰期；延长酶的半衰期；提高酶的热稳定性；提高酶

47、的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 一、一、 消除酶的被抑制特性消除酶的被抑制特性 19851985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用突变技术，用1919种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第蛋白酶分子第222222位残基上易氧化的位残基上易氧化的MetMet，获得了一系，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用列活性差异很大的突变酶。发现除了用CysCys代替代替MetMet的的突变体以外，其他突

48、变体的酶活性都降低了。突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。 二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性 溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第域之间。该酶分子在第9797位和位和5454位残基上是两个未形位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分共价化学键，

49、有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。键。 在高温下在高温下AsnAsn和和GlnGln容易脱氨形成容易脱氨形成AspAsp和和GluGlu，而导，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2 2个个AsnAsn，由，

50、由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第1414位和位和第第7878位上的位上的2 2个个AsnAsn分别转变成分别转变成Thr(Thr(苏氨酸苏氨酸) )和和Ile(Ile(异亮氨酸异亮氨酸) )残基，大幅度提高突变酶的热稳定残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。性。 三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性 四、四、 改变酶的最适改变酶的最适pH值条件值条件 葡萄糖异构酶最适葡萄糖异构酶最适pHpH为碱