通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组测序微生物的发现单细胞课件.ppt

1、使用多重置换扩增（MDA）技术对单细胞基因组进行测序Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification摘要l目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到的扩增DNA进行测序。在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟枪法测序

2、来指导构建基因芯片。背景知识lMDA是最近几年发展起来的一种全基因组扩增技术,它采用具有高度延伸活性的DNA聚合酶和耐核酸外切酶的随机引物在等温条件下对基因组进行扩增的方法,这种方法是以链置换为基础,最初被用于扩增巨大的环状DNA如质粒和噬菌体DNA,现在也被用于线型DNA的扩增,它能对全基因组进行高保真的均匀扩增, 扩增出10100 kb大小的片段,能提供大量均一完整的全基因组序列。MDA反应示意图 通过利用扩增DNA为模板使对单个细胞的DNA进行测序成为可能。多重置换扩增（ MDA ）可以将一个细菌中很少的几飞克的DNA放大到可用于测序的微克的DNA。 MDA作为环境研究方法的一个巨大突破

3、，能够用来引导并可能成为微生物遗传学、生态学及传染性疾病研究的一种新的研究策略。先前的新发现的微生物只能通过培养菌株成长到足够的数量，以提供足够的DNA 模板才能测序。然而，只有不到1的微生物已被成功培养。对自然环境的深入研究将出现大量新的不能培养的生物体，它们成为通过传统的基因组研究方法研究的重大障碍。在这项工作中，单细胞测序的出现开辟了一个新的领域，可以直接从单个细胞获取DNA模板而不需要培养方法的改进。 l 最近的工作表明了单细胞测序能有利的揭示环境和生理研究甚至从局部草案基因组中预测基因的存在。基因组数据还可以在这个过程中协助作用，最终发展为新的培养方法，这仍然是一个需要充分认识生物有

4、机体的极为重要的目标。代谢途径的鉴定可以预测培养基和培养条件的设计。基于MDA的单细胞基因组学的另一个好处是它很容易自动化，并可以与高通量细胞筛选大量的微生物相结合。MDA的反应物经PCR筛选信号序列，如16 S rRNA和recA基因，可以用来确定目的基因，用于其它的分析。应用：l通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组测序l微生物的发现l单细胞测序和宏基因组学方法的综合l近来对MDA方法的改进l MDA反应利用随机引物和独特的Phi 29 DNA 聚合酶(该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有35外切酶活性，可以保证扩增的高保真性

5、) 反应扩增DNA。一个链置换反应使从每个模板得到的多个副本作为聚合酶合成新链 ，同时取代先前延长的链。与MDA相比，老的基于随机或简并引物PCR来进行全基因组扩增的方法，MDA创造了更大的扩增偏好性。它们还可以产生很短的扩增产物。MDA扩增平均12 kb的长度和范围大于100 kb的序列，使它们更适合用于克隆和DNA测序。 来自相同细胞株的几个不同的细胞的MDA产物也可以被用来完成基因组测序。扩增的偏好性在一次MDA反应到下面的反应中相当随机的发生在不同的序列。同样，一次MDA反应中序列的缺失也会发生在其它的细胞中。为确认MDAs的选择能从相同细胞株真实获得，PCR筛选和循环测序可以对MDA

6、反应产物的16S rRNA基因和其他标记基因进行。从同样的细胞类型产生的单细胞MDA产物的所产生的汇集物可以提供较全面的甚至代表所有的序列，也是达到基因文库完整覆盖的一种很有前途的策略。 l 另外，如果在MDA反应前可以对细胞汇集，基因组的覆盖范围能够得以改善。在细胞分选技术中通过荧光原位杂交（ FISH ）探针或独特的自体荧光，通过在显微操作中的形态特征观察，如果一个单一的细胞株因为局部富集生长或一些微环境作用（例如感染细菌或作为宿主的共生）占主导地位，这使得对相同细胞株的细胞进行识别成为可能。l FISH技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切

7、片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 l 从单一的未培养细胞测序首先是通过对用显微操作分离的取自环境的土壤细菌进行了分析。显微操作高度确保了只有一个细胞被选择，也提供了在分离过程中观察和拍照的形态学信息。使用单细胞MDAs产物作为模板，对16S rRNA基因进行PCR得到测序的基因文库。以往的获得的最初一些基因组序列，是通过使用FISH的特异探针来选取

8、单个细胞。l 目前，一个混合的策略可以通过16S rRNA基因的PCR提取环境总DNA，基于观测种群的16S rRNA FISH 探针来分离细胞，通过单细胞测序并结合宏基因组的鸟枪测序来合并基因组。l FISH探针被用来通过细胞流式细胞仪分离候选细胞。l 细胞通过微流控芯片分离，并在1个60 nl的体系内进行MDA。此方法使用微流控渠道以达到细胞分选，以及MDA的小体积反应能达到单拷贝DNA模板的更好目标。即使单一细胞的部分序列也可以大大的推动生物学研究： l一个单细胞测序的序列草图估计可以覆盖Beggiatoa spp基因组的70，这种细菌为一种至今尚未成功培养的海洋细菌。l预测基因被用来确

9、定硫氧化，硝呼吸和氧呼吸及CO2固定的一些关键酶。它还应当可能用于克隆新基因及表达编码蛋白的研究。 lMDA反应物可以与PCR引物一起筛选已知序列或通过简并引物搜索基因家族的新成员，提供了一个发现具有科学或商业价值蛋白的新途径。微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统,将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上。加载生物样品和反应液后,采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动,形成微流路,于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中,对样品进行

10、快速、准确和高通量分析。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构,如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应器等。l 对于单细胞研究，获得的所有序列可以归结于同一品种。这些遗传上相联系的序列可快速有效的的指导对环境样品宏基因组学的鸟枪测序的结合。宏基因组学研究为微生物基因组学提供了重要的作用。l 正确的将序列结合到当前的数以千计的个体物种，一直是极为困难的。单细胞序列为这个瓶颈提供一个解决方案。它们可以通过对鸟枪测序结果进行筛选找到那些来自同一生物体的基因 。近来对MDA

11、 方法的改进：l 减少MDA的反应体积：通过减少污染的扩增DNA和非特异性的合成，如引物二聚体，本质上就是通过消除不必要的反应体积增强特异性的扩增。l 通过使用60 nl微流控反应可提高扩增的特异性。l 在MDA中，分支的DNA 中间体的形成可导致在一些对初始模板DNA链的延长，然后被置换并对一个不同的模板延长，其结果是形成嵌合体。完整的MDA反应物和S1核酸酶处理后可以消除DNA的单链形式，这可使使嵌合体达到80的减少。l 对嵌合体形成酶路径的了解目前正被用来减少嵌合体的发生。结论：l 从单个的细菌基因组测序的目标现在已经通过许多取得了足够的可靠性的令人振奋的新方法得到应用。l MDA是目前

12、正在开发的可用于从低数量的真核微生物测序的方法。荧光激活流式细胞仪被用来收集同一品种的多个细胞的。单一的真核细胞的测序应是可行且必要的。l 细胞分选的高通量方法和基于MDA的DNA 扩增，大大加快了使用未培养微生物来实现微生物发现的步伐。l 单细胞测序与宏基因组的数据相结合，将成为一种将单细胞测序指导结合多物种的鸟枪测序纳入到单个基因组中的强大工具。 利用单细胞方法在人类的生物群落中发现新型微生物现正被一些实验室提出。 对于传染病的研究，它将有可能用来确定从临床标本中无选择性偏好的培养方法中遗传变异的病原菌。从单细胞获得的遗传连锁的致病因素和其他基因与从宏基因组数据获得的全基因组频率相对应。或

13、许，全环境基因组的方法的可能的最大挑战是巨大的遗传多样性，即使在相同株的成员间也存在。 到此为止，单细胞测序将对揭示多样性的程度和性质，种的本质核心或一致基因，自然演变中水平基因转移的作用，环境因素与多样性关系等方面起重要作用。最后，为实现更完整的有代表性的基因组的目标，MDA反应酶学的改进还在继续进行。 l Sanger测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的ddNTP而定。l 焦磷酸测序：焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术.在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的.此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。l 鸟枪法测序：将基因组DNA打成小片段进行测序，然后再将这些小的片段拼接起来，重新组装成一个完整的基因组。