流式细胞仪原理课件.ppt

1、流式细胞术的原理 流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。 基本原理基本原理流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光源检测信号光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计：计算机 流流 路路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦FLOW CELLInjector TipF

2、luorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid光光 路路光源光源检测信号检测信号 散射光信号散射光信号FS: 前向角散射光前向角散射光SS: 侧向角散射光侧向角散射光(90度散射光度散射光) 荧光信号荧光信号荧光染料荧光染料光学滤片光学滤片 颜色补偿颜色补偿电路电路-光电倍增管光电倍增管 光光 路路 光源与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,空冷/水冷Enterprise II水冷Innova300系列Innova70系列检测信号检测信号 散射光信号散射光

3、信号前向散射光前向散射光(FS) FS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小 前向散射光前向散射光 散射光信号散射光信号 侧向散射光侧向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒

4、多少, 核质比 侧向散射光侧向散射光90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000Forward Scatter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionForward Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale 光路光路-荧光信号荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检

5、测)这些光学信号荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 670 光路光路 - 滤片特性滤片特性 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光

6、这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) SourcelightPassedlightCertain colorsabsorbedAbsorbancefilter标准带通滤片标准带通滤片 band pass 光源光源通过的光谱通过的光谱630/30 nm BP615-645 nm light Unique 4-Color Single Laser DesignAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide S

7、catterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DLPC7Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5)750BP FL4 (PC7)488DL488BK550DL600DL

8、 700DLOptics - Detectors Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 不同的脉冲信号被转换成数字通道不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程的过程 Log FITC 1000 100 10 1 110.1Count 30 700 150ImmunophenotypingImmunophenotypinguSingle Parameter Histogram: Count vs MFI 各荧光染料发射的荧光信号有重迭, 因此要进行色补偿以除去重迭部分emission intensitywavelengthFL

9、BFLA光谱重叠需进行色补偿光谱重叠需进行色补偿减法颜色补偿减法颜色补偿 减法补偿 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur 补偿试剂FITCPEFITCPEFITCPE全矩阵颜色补偿全矩阵颜色补偿全矩阵 在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率 通过矩阵去除或加上信号 EPICS XL Cytomics FC500FL1FL2FL3FL4PMT155.00.50.30.3PMT21.747.01.20.3PMT30.67.445.00.3PMT40.21.43.428.0Normalized Relative IntensityFL1F

10、L2FL3FL4PMT1100.01.10.71.1PMT23.1100.02.71.1PMT31.115.7100.01.1PMT40.43.07.6100.0PercentageMean IntensitySingle Parameter MnIIOT CD45CD45-ECD PMT 1 PMT 2 PMT 3 PMT 4 FL1 100 -1.28 -1.08 -0.74 FL2 -3.5 100 -7.41 -0.44 FL3 1.01 -41.25 100 0.18 FL4 -0.04 6.67 -24.40 100 EPICS XLEPICS XL临床科研型流式细胞仪临床科研型流

11、式细胞仪 EPICS XLEPICS XL合理的光路设计 -单激光激发四色荧光标准模式确保在同一个细胞上获得最多的信息 EPICS XL直线光路设计，光损失少可互换式光学滤片，方便新染料的应用Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645

12、DLAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5)750BP FL4 (PC7)488DL488BK550DL600DL 700DLPC7With Thanks to Dr. Frank SchniedersGentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie Inst

13、itut fr Medizinische Biochemie und MolekularbiologieUniversittsklinikum Hamburg-EppendorfEGFP, EYFP and 7-AADWith EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-SoftwareHEK293Human EmbryonalKidney Cells 293Filter SetBP 510LAF21BP 550LAF30Dichroic Mirror 525DRLPCell Viability with 7-AADHEK293-cells with EYFP Transfecti

14、onHEK293-cells with EGFP TransfectionMixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-CellsEGFP . Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm)EYFP . Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm)7-AAD .7-Aminoactinomycin (Viability Stain ; Ex 546; Em 647 nm) 四色荧光中的补偿传统补偿与传统补偿与ADC补偿补偿E

15、PICS XLEPICS XL采用最先进的通讯传输设计 -光纤通讯与数字信号传输EPICS XL中的PRISM功能-将多张直方图浓缩在一张上Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., page 355“The XL is presently unique among production flow cytometer in its use of digital electronics for transformation between linear and logarithmic signals and of computer

16、algorithm for fluorescence compensation. I have already praised this approach a few times (pp. 19, 166, 189), while also nothing that it probably represented the only practical way to implement another feature which presently distinguishes the EPICS XL from its competitors, i.e., 4-color fluorescenc

17、e analysis. Both features will have the other manufacturers trying to play catch-up for a while.”“XL因為有全數字化的線性-數轉換及電腦軟體螢光補償而成為現今流式細胞分析儀系統中最獨特的產品.個人也多次表示欽佩(第19,166,189頁). EPICS XL(單一激光產生)的四個螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕”.摘自”流式細胞分析儀系統實務第三版,1995.” 作者Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometr

18、y, 3rd ed., page 355专家评述专家评述来自ISAC的报告产品介绍产品介绍 XL设计的所有优势：设计的所有优势：单激光激发四色荧光光纤通讯数字化信号传递可互换式光学滤片，无需调整光路具有620nm的滤片,最适合DNA倍体分析利用软件进行全矩阵优化（ADC)颜色补偿PRISM 浓缩柱形图 快速调节电压快速调整补偿补偿向导利用生物样本进行颜色补偿WINDOWS界面操作软件Cytomics FC500 MCL 进样 MCL 自动模式. MCL 直接( 或手动) 模式. 单管固定位置进样. 可以暂停 / 旋转以方便随时添加刺激剂等 条码识别 样本混匀产品介绍：硬件产品介绍：硬件产品介绍

19、：硬件产品介绍：硬件 可选MPL (研究用) 24 孔 每孔样本体积0.5 2.5 ml 96 孔 最少体积200 ul 40 管 (12x75mm) 最少体积500 ul 固定样本体积 吸样25 ul 样本混匀功能FC500特点特点 1根激光同时激发5色荧光 2根激光可选 3种进样方式 4种直方图分辨率 5色荧光同时检测全球第一台单激光激发五色荧光的流式细胞仪全球唯一一台获得Quality leadership Award 的流式细胞仪全球唯一一台获得IBO设计大奖的流式细胞仪全数字化流式细胞仪全自动软件操作, 全面兼容LIS 系统全自动进样系统全面广泛的临床及科研应用临床应用临床应用淋巴细

20、胞亚群分析淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测细胞移植的免疫状态监测造血干细胞计数造血干细胞计数阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿HLA-B27HLA-B27检查检查血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病HIV免疫分型，免疫分型，CD4绝对计数绝对计数=免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞活化、细胞因子）免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞活化、细胞因子）=磷酸化蛋白的检测磷酸化蛋白的检测=干细胞研究干细胞研究/树突细胞研究树突细胞研究=细胞功能研究（细胞内细胞功能研究（细胞内PH值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位）线粒体膜电位）=血小板分析（心脑血管疾病）血小板分析（心脑血管疾病）=肿瘤相关基因表达的研究肿瘤相关基因表达的研究=抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究=细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析=细胞凋亡及凋亡相关蛋白细胞凋亡及凋亡相关蛋白=转染转染&基因沉默效率检测基因沉默效率检测=细胞分选、分选后培养及相关生物学研究细胞分选、分选后培养及相关生物学研究=科研应用科研应用