核酸血液筛查(上海浩源)课件.ppt

1、核酸血液筛查核酸血液筛查2022-3-25分子生物学概论分子生物学概论一核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术二三目目 录录核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统四血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存三PCRPCR实验室的污染防治实验室的污染防治2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 核酸的分子组成核酸的分子组成- -核苷酸核苷酸2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 DNADNA的一级结构的一级结构CytosineAdenineThymineGuanineHydrogen BondsDeoxyribose(Sugar molecule)Phos

2、phoric Acid(Phosphate molecule)由A/T/G/C四种单核苷酸组成2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 DNADNA的二级结构的二级结构DNA分子由相互平行、分子由相互平行、走向相反、碱基互补走向相反、碱基互补的两条脱氧核糖核苷的两条脱氧核糖核苷酸链围绕同一中心轴，酸链围绕同一中心轴，盘绕成双螺旋结构，盘绕成双螺旋结构，螺旋的一侧为大沟，螺旋的一侧为大沟，另一侧为小沟。平行另一侧为小沟。平行链对应碱基总是链对应碱基总是A=T、G = C配对配对（base pairing)或互或互补，形成稳定联系。补，形成稳定联系。DNA双螺旋结构双螺旋结构2022-3-

3、25 分子生物学概论分子生物学概论 核酸的理化性质核酸的理化性质DNA的热变性与复性的热变性与复性DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火热变性后缓慢冷却处理过程称退火 annealingDNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。键联系，两链维持分离状态。慢慢骤骤2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 核酸分子杂交核酸分子杂交 hybridizationhybridization 当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分

4、子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。交。2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 DNADNA半保留复制半保留复制DNA合成进行时，以两条亲代合成进行时，以两条亲代DNA链链中的每中的每条链为模板，在条链为模板，在DNA指导下指导下的的DNA聚合酶催化下，按聚合酶催化下，按A与与T、G与与C碱基配对原则合成子代碱基配对原则合成子代DNA的过程的过程称称DNA的复制的复制(replication)。由于复制。由于复制合成的

5、子代合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代链中有一条来自亲代DNA，另一条是，另一条是以前者为模板新合成的子代以前者为模板新合成的子代DNA链，链，所以所以DNA的这种合成作用又称半保留的这种合成作用又称半保留复制复制(semiconservative replication)。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术磁珠法提取核酸磁珠法提取核酸荧光荧光PCR技术与技术与TMA技术技术UNG-dUTP防污染系统防污染系统内对照分子内对照分子2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术

6、磁珠法提取核酸磁珠法提取核酸 样品核酸提取样品核酸提取 磁珠法磁珠法2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 磁珠法提取核酸磁珠法提取核酸第一步：细胞的裂解：第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液破碎细胞，并向溶液中加入磁珠。中加入磁珠。 第二步：结合核酸：第二步：结合核酸：pH较较低，在高盐环境下，硅胶磁低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合化试剂中的核酸结合 2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 磁珠法提取核酸磁珠法提取核酸第三步：洗涤：用洗第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲涤液将非核酸成分冲

7、洗分离（为清洗干净洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多该步骤可以重复多次）。次）。 第四步：核酸的洗脱：第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来。下，核酸被洗脱下来。 2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 PCRPCR技术技术5533d.NTPs耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶引物引物5353535353535353535353535353加入试管中加入试管中2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 PCRPCR技术技术循环循环延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环2

8、022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 PCRPCR技术技术5353535355335353第二个循环第二个循环4 4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8 8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n n个循环个循环2 2n n个拷贝个拷贝2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 PCRPCR技术技术2022-3-25 分子生物学概论分子生物学概论 TMATMA技术技术2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 TMATMA与与PCRPCR比较比较TMAPCR扩增原理扩增原理模拟自然模拟自然 DNA

9、 转录成转录成 mRNA 的过程的过程模拟自然模拟自然DNA复制的过程复制的过程靶目标靶目标RNADNA酶酶MMLV逆转录酶及逆转录酶及T7 RNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶反应体系反应体系两种酶，两条引物，两种酶，两条引物，dNTP, NTP一种酶，一对引物，一种酶，一对引物，dNTP温度条件温度条件恒温（恒温（41.5 ）循环导热循环导热（变性，退火，延伸）（变性，退火，延伸）扩增仪器扩增仪器水浴箱或者加热块水浴箱或者加热块热循环仪热循环仪扩增产物扩增产物RNADNA扩增速度扩增速度每个循环可以生成每个循环可以生成100-1000个复制物个复制物，在，在15-30分钟内可增加分钟内可

10、增加10亿倍复制物亿倍复制物以以2n扩增，扩增，23 h就能将待扩目的就能将待扩目的基因扩增放大基因扩增放大10亿倍亿倍2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 荧光荧光PCRPCR技术技术SYBR GREENSYBR GREENMolecularbeaconMolecularbeacon2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 TaqManTaqMan荧光荧光PCRPCR技术技术2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 TaqManTaqMan荧光荧光PCRPCR技术技术5533d.NTPsThermal Stable DNA Po

11、lymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql l53RQProbe53RQ2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 TaqManTaqMan荧光荧光PCRPCR技术技术5353Extension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaq

12、R5l lR53RQ2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 CTCT值与阈值值与阈值CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 CTCT值与阈值值与阈值实验操作中，实验操作中，CT值定义为值定义为在基线上方产生可检测到的在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时统

13、计学上显著的荧光发射时所对应的所对应的PCR循环次数循环次数（图）。（图）。“基线上方基线上方”也就也就是阈值高度的量化定义是基是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准线范围内荧光信号强度标准偏差的偏差的10倍。阈值所在的倍。阈值所在的横线与横线与PCR扩增曲线的交点扩增曲线的交点所指的所指的PCR循环次数就是循环次数就是CT值。值。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 荧光定量荧光定量PCRPCR检测流程图检测流程图2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 UNG-dUTPUNG-dUTP防污染系统防污染系统UUUU50,2min50,2m

14、inUNGUNG：Uracil-DNA Glycosylase，也称为，也称为UDG，尿嘧啶糖基化酶，尿嘧啶糖基化酶2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 UNGUNG生化特性生化特性1234无作用：游离U、A、T、G、C和RNA不耐热：37-5095分子量小球蛋白发挥作用不依赖于Mg2+作用范围：单链和双链U碱基糖苷键2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 dUTP-UNG dUTP-UNG系统实施的必要性系统实施的必要性产物污染交叉污染试剂污染天然核酸 的污染实验室污染物理分区紫外线照射高压消毒10%次氯酸钠DNase I消化UNG消化2022-

15、3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 dUTP-UNG dUTP-UNG作用原理作用原理特异地识别特异地识别DNA分子中尿嘧啶核苷分子中尿嘧啶核苷切割下来，形成自由的尿嘧啶和切割下来，形成自由的尿嘧啶和“糖糖-磷酸磷酸”骨架骨架加热或碱性条件下，加热或碱性条件下，DNA在在“糖糖-磷酸骨架磷酸骨架”处断裂处断裂dUTP代替代替dTTP扩增，形成扩增，形成UNG有效作用底物有效作用底物U-DNA2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 dUTP-UNG dUTP-UNG作用示意图作用示意图2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 dUTP-U

16、NG dUTP-UNG优缺点优缺点缺点缺点优点优点TextText防止含dU产物的污染不影响目的片段的扩增作用条件简单，易实现。只防自身产物的污染，不只防自身产物的污染，不防天然产物的污染。防天然产物的污染。若混有核酸酶，会同时分若混有核酸酶，会同时分解目的产物。解目的产物。UNG致使致使CT值增加，值增加，易易导致假阴性导致假阴性。dUTP在对在对GC丰富的模板丰富的模板时作用不大。时作用不大。灭活不够完全。灭活不够完全。相对用相对用dTTP，成本高。，成本高。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 内对照分子内对照分子TextText内参照的概念人工合成的小片段DNA

17、，放在反应液中和待测目的基因一起扩增。 内对照是PCR方法检测疾病基因的必需成分，是防止假阴性、提高检测结果可靠性的重要标示。内对照对整个实验流程，包括样品提取、分装、PCR热循环仪孔间差、PCR抑制元素等等可能的影响因素进行监控，防止假阴性，提高安全性2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 竞争性内对照分子竞争性内对照分子355335120291310 (BP)两端为特异性两端为特异性引物引物目的基因片段目的基因片段 内对照顺序内对照顺序竞争性内对照的概念与目的基因使用相同的引物。扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核

18、酸血液筛查相关技术 竞争性内对照分子竞争性内对照分子355335120291310 (BP)内对照特异性内对照特异性引物引物目的基因片段目的基因片段 内对照顺序内对照顺序非竞争性内对照的概念与目的基因使用不同的引物。扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。目的基因特异性目的基因特异性引物引物2022-3-25 核酸血液筛查相关技术核酸血液筛查相关技术 内对照分子内对照分子内对照的作用内对照的作用 真实反应扩增效率避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最重视的问题之一，内标全程进行质量监控质控血筛核酸检测的内对照设计理念血筛核酸检测的内对照设计理念中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取

19、、反转录、及扩增过程的效率。内对照选用：最好能达到上述三个条件，且能顾及仿真病毒的安全性。2022-3-25 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统核酸检测样本汇集设备核酸检测样本汇集设备自动化核酸提取设备自动化核酸提取设备PCRPCR扩增和扩增产物的检测设备扩增和扩增产物的检测设备2022-3-25 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统分析后采集容器采集方式保存运输不合格样本：脂血、溶血、样本量不足样本分析中分析前检测结果纯化试剂准备仪器维护自检准备：质控样本试剂前处理混样信息录入扩增检测核酸纯化检测系统试剂设备质控品检测试剂的准备2

20、022-3-25 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统 核酸检测样本汇集设备核酸检测样本汇集设备加样器HAMILTON 液体工作站2022-3-25 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统 自动化核酸提取设备自动化核酸提取设备自动化核酸提取(EZbead system-32)2022-3-25 核酸血液筛查系统核酸血液筛查系统 PCRPCR扩增和扩增产物的检测设备扩增和扩增产物的检测设备ABI7500实时荧光定量PCR仪2022-3-25血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存 血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存样本的采集样本的采集样本的运送

21、样本的运送样本的接收与保存样本的接收与保存2022-3-25血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存 关注采集、保存、运输的细节关注采集、保存、运输的细节运输条件离心采血管2022-3-25 标本的采集标本的采集- -采血管采血管无菌无菌真空采血管一、血清管 普通血清管 带分离胶的血清管二、抗凝管 EDTA 2K或3K抗凝管 EDTA 2K抗凝间分离胶（PPT) 枸橼酸钠抗凝管血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 标本的采集标本的采集- -离心离心离心条件离心条件 800-1600g 20min离心分离的时间要求HC

22、V RNA 和HIV RNA研究方式不同（样本、检测）结论差异大离心时间离心时间完成地点完成地点血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 标本的运送标本的运送 2-8C稳定48hr 血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 标本的接收、保存标本的接收、保存 确认标本数量 运输状态 标本状态：溶血、脂血 保存： 用于检测的样本管：检测前保存 用于留样备查的样本：样本量样本量血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 检测前核对检测前核对 状态 标识 接收时间 离

23、心后至检测前2-8C保存不超过48小时血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 长期留样样本长期留样样本 理论上-80 C 保存量：核酸检测样本量比酶免确认实验大 长期保存：保存管密闭程度血站核酸检测样本的采集、运送和保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存2022-3-25 PCR实验室污染防治实验室污染防治 PCRPCR实验室污染防治实验室污染防治PCRPCR实验室的分区实验室的分区实验室人员基本要求实验室人员基本要求PCRPCR实验室管理实验室管理核酸扩增仪器设备的质控核酸扩增仪器设备的质控2022-3-25 PCR实验室污染防治实验室污染防治

24、 PCRPCR实验室的分区实验室的分区一个基本符合要求的PCR实验室应包括34个区 试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区 各区在物理空间上完全互相独立，使用功能上互相分割 各区之间不能有空气直接相通 各区使用的仪器设备、移液器、Tip、试管架、笔记本、记号笔、手套等包括清洁用物品都必需执行专区专用原则。2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计A A产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标

25、本制备区试剂准备区试剂准备区2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计B B产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 核酸扩增检测实验室设计的一般原则核酸扩增检测实验室设计的一般原则 各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作“十六字口诀十六字口诀”2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 核酸扩

26、增实验室的工作流程核酸扩增实验室的工作流程试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩增区及扩增产物分析区扩增区及扩增产物分析区2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 实验室人员基本要求实验室人员基本要求 进入实验室人员要按规定穿工作服 进行各项检验的人员禁止佩戴项链、首饰等物品 实验室内禁止大声喧哗 实验过程中禁止讲话，必需讲话时应在实验允许暂定的某个点暂停实验，回答必需回答的问题2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 PCR实验室管理实验室管理共同维护实验室环境卫生实验用物品摆放整齐、规范移液器-及时清洁、定期校验、使用后归放原处Tip盒 - 打开Ti

27、p盒的盒盖应朝上放置，用完后随手盖上。Tip盒内要定期清洁Tip的使用-实验用Tip有散装和盒装，使用散装Tip时应提前将其装入相应的Tip盒内，要带手套装Tip，手套必需是未使用过，装的过程，带手套的手禁止接触其它物体表面。散装Tip高压消毒，烘干后使用。2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 核酸扩增仪器设备的质控核酸扩增仪器设备的质控2022-3-25 PCR实验室的污染防治实验室的污染防治 污染的防治污染的防治 实验室功能分区 仪器设备、耗材、记录、工作服专区专用 严格执行实验室工作流程（试剂准备样本制备扩增及结果分析） 清洁、消毒 了解实验室污染的来源，可能产生污染的实验操作（阳性样本的稀释、质粒的稀释，实验过程中每一次的开盖过程） 养成良好的实验室操作习惯，规范行为2022-3-25