流式细胞术在科研中的应用描述课件.pptx

1、什么是流式细胞仪流式细胞仪实物BD FACSVantageBD-Calibur 流式细胞仪可检测到的细胞参数颗粒度颗粒度细胞大小细胞大小=前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性相对复杂性外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色n流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点

2、图和直方图。图和直方图。n几个概念：几个概念：n%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。阳性细胞的数量。nMean：平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。nGeo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。为偏态分布时一般用该值。 散点图 密度图二维等高图直方图图 报告中常见的几种流式细胞图R1File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03QuadEvents% Gated X Mean

3、Y MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.809.87图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=点图分析点图分析流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=直方图分析直方图分析图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势今天主要内容：流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术检测细胞凋亡细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析细胞凋亡细胞凋亡Active Caspases-3细胞

4、凋亡细胞凋亡Caspases-3细胞凋亡细胞凋亡Annexin 凋亡检测（凋亡检测（Annexin V/PIAnnexin V/PI法）法）PIAnnexin V-FITCAnnexin V-FITC（Propidium iodide碘化丙啶），碘化丙啶）， 单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 DNA细胞周期分析细胞周期分析细胞周期细胞周期 200 400 600 8001000DNA含量含量细细胞胞数数量量2倍体倍体异倍体异倍体4倍体倍体肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体含量与凋亡关系

5、含量与凋亡关系nDNA亚亚G1峰的检测：利用峰的检测：利用PI染色，检测具有染色，检测具有亚亚G1期期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。n凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的的DNA片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体DNA含含量减少，成为亚量减少，成为亚2倍体。倍体。Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr

6、.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 R1图图 FCM测试细胞周测试细胞周 期分布和凋亡期分布和凋亡分选：分选：488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS

7、SensorFluorescence detector流式分选与分子生物学研究流式分选与分子生物学研究Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋流式液相多重蛋白白定量技术定量技术导言导言CBACBA技术简介技术简介+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBeadBD Cytometric Bead Array123不同强度红色荧光不同强度红色荧光的捕获微球，在的捕获微球，在FCM FL3检测检测不同的目标蛋白不同的目标蛋白PE 标记的检测抗体，标记的检测抗体，在在FCM

8、FL2检测。检测。 PE的荧光强度即反映的荧光强度即反映靶蛋白的含量靶蛋白的含量456Human Th1/Th2 Lymphokine CBAHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 10 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard20 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard40 pg/ml

9、CBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard80 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard156 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard312 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard625 pg/mlCBA Assay Standard cont.

10、cont.Chemokine-I CBA Assay Standard1250 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard2500 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay StandardHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准曲线标准曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IF

11、N- IL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.26 B = 5.00 C = 3.60 D = 3.89 R2 = 0.9973Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.29 B = 4.24 C = 3.43 D = 4.33 R2 = 0.9991Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logis

12、ticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.34 B = 4.11 C = 3.42 D = 4.45 R2 = 0.9987Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.86 C = 3.30 D = 4.45 R2 = 0.9980Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.77 C = 3.37 D = 4.77 R

13、2 = 0.9997Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.33 B = 4.08 C = 3.24 D = 4.42 R2 = 0.9987T TN NF F- -a a110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IF FN N- -g g1101001000110100100010000C Co on n

14、c ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IL L- -1 10 0110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -4 4110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IL L- -5 5110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -2 2110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI I总结