流式细胞仪的应用课件.pptx

1、流式细胞术的应用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是一种近年发展起来的比较先进的技术，它利用流式细胞仪对特定细胞群体进行分选或对生物微粒进行多参数快速定量分析1 。FCM集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。FACSCalibur性能卓越，不仅通过其用户友好的整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型，CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，其更以其完美的三色分析功能成为遗传、肿瘤、血液、免疫功能等诸多研究不可或缺的重要工具。流式细胞仪特点 开滦医院引进的BD公司FACSCalibur流

2、式细胞仪BD LSRBD LSR FACSAriaFACSAria 流式细胞仪的工作原理 信号检测- -散色光 它反应细胞FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分信号检测-荧光信号 流式细胞术的操作流程流式细胞仪检测范围 1 对细胞抗原的检测各种血细胞都有相应的抗原表达方式，并且不同成熟阶段表达的抗原种类也不完全相同。通过免疫荧光标记技术将细胞表面抗原同标记有特异染料的一种以上单克隆抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下产生几种特异荧光色，由荧光检测器对每个细

3、胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，分析得到细胞群体的多种表面抗原的表达情况。FCM也可用于特异性细胞质内或细胞核上抗原的检测，并协同其他实验指标预示疾病的预后2 。FCM也为网织红细胞计数提供了快速、准确的测试手段，可通过某些染料与网红中RNA结合，在FCM测量时发出特定颜色的荧光，进行单参数定量RNA。 2 对淋巴细胞及其亚群的分析FCM进行淋巴细胞及其亚群的分析，分类更客观、准确。使用流式细胞仪的绝对计数系统，即加入已知数量的荧光微球，通过仪器测定时收获的细胞数量和微球数量及血液标本用量，直接得到每微升全血中T淋巴细胞亚群的绝对计数（个/l）3 。用FCM检测PBMC中p2

4、4、p24nef、p18等HIV抗原阳性的CD4 + 细胞数可监测体内HIV复制情况，结果表明HIV抗原阳性细胞与CD4 + 细胞数量负相关 4 。 T淋巴细胞检测 CD8+Ts淋巴细胞检测 B淋巴细胞检测 NK细胞检测 3 白细胞分类分析利用FCM的体积测定和细胞结构测定来检测每个白细胞的光散色强度，它与细胞体积、细胞膜结构、细胞核形状、细胞质性状等多种因素有关，经过分析可得到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的检测结果。这种方法应用于血细胞计数速度快、结果准确，大大提高了临床实验室的工作效率 5 。 4 病毒抗原的检测FCM既可用于检测受染细胞内的病毒抗原，也可检测受染细胞表面的

5、病毒抗原。由于FCM检测的是单个细胞，因此FCM检测受染细胞适用于血液、支气管灌洗液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞。同时由于FCM为多参数分析，因此可在单个细胞中同时获得多个分析参数并能定量检出受染细胞。当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时，FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原 6 。5 病毒抗体检测利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作为载体的病毒抗体FCM分析技术已广泛应用。结合流式细胞仪与微球杂交法可同步检测同一反应管中HIV、HCV、HBV的数目和种类，其基本原理为将检测不同病原体的探针分别包被微球，流式细胞仪分辨特异性结合

6、后发出的不同强度的荧光。当用FCM技术检测HCV核心抗原、NS 3 抗原抗体时，其灵敏度比酶标免疫技术高5倍左右 7 6 在器官移植中的作用FCM通过检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体，根据抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同，抗体介导的排斥反应也有所不同，FCM比传统方法更灵敏、操作时间更短并可同时检测细胞亚型、分辨出IgG和IgM抗体。巨细胞病毒（CMV）能在白细胞内繁殖并合成CMV特异性蛋白，通过FCM检测CMV特异性抗原及其抗原分泌量，这种技术用于CMV感染检测时感染后4h便可检出T淋巴母细胞中CMV-DNA，从而可快速、准确地反映CMV在移植受者中的早期感染状况，对预防和减

7、少感染具有重要意义 8 。以FCM监测肾移植受体CD8 + 、CD38 + 、T细胞亚群的变化也可监测CMV感染 9 。7 检测血小板自身抗体FCM检测PAIgG与ELISA相比更简便省时，检测中操作步骤少。由于血小板被抗体-荧光素标记而显示阳性，所以不受其它种类细胞或碎片的影响，重复性好，可检测成批或单个标本，可直观地显示结合PAIgG量不同的血小板群体，并可在同一份标本上同时测定聚集和释放功能 10 。8 在白血病诊断中的作用白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后异常增殖的结果，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志可以对白血病进行免疫分型。过去对造血细胞和免疫细胞分类主要是依据细胞形态学

8、和细胞免疫化学染色来进行的，现在将多种检测手段相结合，可为临床诊断、治疗监测和预后提供更多、更有力的依据。通过FCM检测各种急性白血病细胞表面抗原的表达，对临床诊断尤为重要 11 。9 在肿瘤诊断中的作用通过DNA含量分析的细胞周期分布，可反映肿瘤细胞的增殖状态，对治疗及预后有十分重要的意义。近年来，流式细胞测量法DNA分析越来越多地应用于实体瘤患者。DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病变发生早期癌变的一个早期指标 12 。10 在微型生物学研究中的应用从现有的微型生物核糖体RNA序列出发，设计分类专用的核酸探针，它们能与核糖体RNA分子一些区域互补

9、，而这些RNA分子对于目标分类群是唯一的，通过荧光标记寡核苷酸链探针与细胞内同源RNA序列结合，目标种可被测出，它们的系统发育被确定。在这一研究中，通过原位杂交，用FCM确定杂交信号，可定量杂交信号强度，而细胞和特异探针杂交的平均荧光强度与细胞和非特异探针杂交平均荧光强度的比率，能计算和估测探针特异性和灵敏性。由此确定微型生物DNA含量与倍体水平 13 11 用于抗生素敏感性试验近年来，FCM用于细菌的药敏效应研究已有较大发展，FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌活力和功能状态，由于速度快，该方法已被建议用作临床实验室的常规药敏试验 14。综上所述，FCM具有快速、灵敏及能同时进行多参数分析的

10、优点，广泛应用于多种学科，具有广阔的应用前景。目前的流式细胞仪应用研究1、2 345癌症患者外周血细胞DNA与T细胞亚群、NK细胞活性关系的研究 白血病的分型肝癌患者免疫性预后的研究中西医结合治疗胰腺炎后外周血中T细胞亚群的变化分析（备选题）（备选题）参考文献1 Grogan WM，Collins JM.Guide to flow cytometry methods.New York:Marcel Dekker，1990，29-190.2 Islam D，Lindberg AA，Christensson B.Peripheral blood cell prepare in fluences t

11、he level of expression of leukocyte cell surface marshal assessed with quantitative multicolor flow cytometry.Cytometry，1996，22:128-134.3 Schnizlein-Bick CT，Spritzler J，Wilkening CL，et al.Evaluation of TruCount absolute-count tube for determining CD4and CD8cell numbers in human immunodeficiency viru

12、s-positive adults.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7:336-343.4 Ghate MV，Mehendale SM，Mahajan BA，et al.Relationship between clinical condition and CD4counts in HIV-in fected predicted persons in Pune，maharashtra，India.Natl Med J India，2000，13（4）:183-187.5 Impert MBM，Nell R Anne SP，et al.Development of a m

13、ethod direct quantification of cytomegalovirus antigenemia by flow cytometry.Clin Microbiol Infect，1997，10:2665-2669.6 Iannelli DD，Apice L，Cottone C，et al.Simultaneous detection of cucumber mosaic virus，tomato mosaic virus and potato virus Y by flow cytometry.J Virol Methods，1997，69:17-145.7 McHugh

14、TM，Viele MK，Chase ES，et al.The sensitive detection and quantitation of antibody to HCV by using a Microsphere-based immunoassay and flow cytometry.Cytometry，1997，29:106-112.8 Kusne S，Grossi P，Irish W，et al.Cytomegalovirus PP65antigen monitoringas a guide for preemptive therapy:cost effective strateg

15、y to prevention of cytomegalovirus disease in adult liver transplant recipient.Transplantation，1999，68:1125-1131.9 Belles-Isles M，Houde I，Lachance JG，et al.Monitoring of cytomegalovirus infections by the CD8 + CD38 + T-cell subset in kidney transplant recipients.Transplantation，1998，65:279-282.10 Levin MD，Vries W，Veld J，et al.Platelet-bound immunoblotting before and after platelet transfusion:Measurement of in vivo binding.Br J Haematol，1999，104:174-183.11 Zoeteweij JP，Eyes ST，Orenstein JM，et al.Identification and rapid quantification of early-and late-lytic huma