第四章体内药物分析方法的建立与验证课件.ppt

1、12第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据 在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，人的研究成果，系统检索国内外的科技文献系统检索国内外的科技文献，对药物在生，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。药物，亦可参考同类药物的相关文献。 检索文献，可在最短时间、最小的花费（磨刀不检索文献，可在最短时间、最小的花费（磨刀

2、不误砍柴工）建立一个好的分析方法！这是误砍柴工）建立一个好的分析方法！这是试验前要做试验前要做的第一件事的第一件事！大四的同学们，你们查过文献吗？大四的同学们，你们查过文献吗？3血药浓度血药浓度 94-2008 5122篇篇4561992年创刊的年创刊的中国临床药学杂志中国临床药学杂志 2001年第二军医大学长海医院主办的年第二军医大学长海医院主办的药学服务与研药学服务与研究究两刊于两刊于20042004年同时成为中国科技核心期刊年同时成为中国科技核心期刊 临床药学专业性的学术期刊有：临床药学专业性的学术期刊有：7不想当将军的士兵不是好士兵不想当将军的士兵不是好士兵 容量大的容量大的U盘：盘：

3、中国临床药学杂志中国临床药学杂志、药学服务与药学服务与研究研究中大量的相关文献拷贝下来中大量的相关文献拷贝下来 另外以另外以 “临床药学临床药学”、“临床药临床药师师”、“合理用药合理用药”、“药学监护药学监护”、“血药浓度血药浓度”等为关键词，查找相关的等为关键词，查找相关的文献，文献，copy !看文献看文献 写论文写论文 提职称提职称8这门课有两个实验，要求大家以这门课有两个实验，要求大家以论文论文的形式写实验报的形式写实验报告！告！实验一实验一 改进的柱前衍生改进的柱前衍生-HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度法测定丙戊酸钠的血药浓度 由老师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设由老

4、师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设计、优化实验条件？计、优化实验条件？实验二实验二 姜黄素姜黄素-PVP固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定 大家到图书馆电子阅览室查阅文献！大家到图书馆电子阅览室查阅文献！ 关键词：姜黄素，血药浓度关键词：姜黄素，血药浓度 或：姜黄素或：姜黄素 ，（药代）动力学，（药代）动力学 要看要看PDF 文档，电脑要安装文档，电脑要安装 ADOBE READER软件软件 910(一一)待测药物的理化性质待测药物的理化性质 药物的药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定决定预处理方

5、法及萃取方法预处理方法及萃取方法具有具有亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取具有具有强极性或亲水性强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取离子对萃取或衍生化后萃取等等具有具有挥发性挥发性GC测定法测定法具有具有光谱或电化学特性光谱或电化学特性分析检测方法分析检测方法药物的药物的稳定性稳定性萃取浓缩技术萃取浓缩技术对酸碱不稳定对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂-一个例子一个例子11另一个“两弹一星”：拯救5亿人的“中国神药” -青蒿素 疟疾是危害人类最大的

6、疾病之一。全球每年疟疟疾是危害人类最大的疾病之一。全球每年疟疾病人超过疾病人超过5亿，死亡亿，死亡100万人以上。万人以上。屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青蒿的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，蒿的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古医书：又翻出古医书： “青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。尽服之。” 和中药常用的煎熬法不同？原来里面和中药常用的煎熬法不同？原来里面用的是青蒿鲜汁！用的是青蒿鲜汁！ 改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达100% 温度！温度！

7、12( (二二) )待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法决定分离萃取方法 指标：提取回收率指标：提取回收率蛋白结合较强（蛋白结合较强（非极性强非极性强）不宜直接采用溶剂不宜直接采用溶剂萃取萃取 ？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定分析检测技术决定分析检测技术浓度较低浓度较低（尤其有（尤其有代谢产物代谢产物共存）共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采

8、用采用HPLC或或LC-MS等分析检测技术等分析检测技术 13二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求 体内药物分析的目的体内药物分析的目的影响分析方法的应用影响分析方法的应用药代动力学药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物产物要求要求同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物 检测检测宽线性范围宽线性范围(CmaxCmax的的1/20，4-5半衰期半衰期)、高灵敏度高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性和高专属性(分离能力分离能力)(原形药

9、物原形药物及其代谢产物的分离及其代谢产物的分离)方法方法不必强调方法的简便、快速，按不必强调方法的简便、快速，按SOP，大多采用，大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS14二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求 临床治疗药物监测临床治疗药物监测 药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近方法方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，大多采用测定，大多采用UV、RIA或或EIA等。？等。？中毒患者的临床抢救中毒患者的临床抢救 药物浓度极高药物浓度极高方法方法不必强调方

10、法的灵敏度，强调方法的不必强调方法的灵敏度，强调方法的和和大多采用色谱及其联用技术大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或或EIA ？15三、生物样品的类型与预处理方法三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品采用采用蛋白沉淀、溶剂萃取蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术预处理技术分析样品较为分析样品较为“干净干净”，可用，可用HPLC检测检测用用RIA分析分析 ？FPIA法法样品的预处理方法可较为样品的预处理方法可较为粗放粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理经过简单的蛋

11、白沉淀或不经任何预处理直接测直接测定定16四、实验室条件四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。器装备，合理选择可行的分析方法。 此外，还应从方法的可行性、每个样品测定此外，还应从方法的可行性、每个样品测定耗时多少（耗时多少（10 min10 min）、操作的难易及技术要求及）、操作的难易及技术要求及仪器、设备要求、费用多少等等方面加以考虑。仪器、设备要求、费用多少等等方面加以考虑。17 在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样

12、在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样中阿齐霉素的浓度范围为中阿齐霉素的浓度范围为5 5 ngng/ ml/ ml1g/ ml1g/ ml ，其检测方法可采用其检测方法可采用HPLC HPLC 法、法、LC-MS LC-MS 法和微生物法法和微生物法等数种方法。若用等数种方法。若用HPLC HPLC 法来检测该样品，由于阿法来检测该样品，由于阿齐霉素的齐霉素的紫外吸收较弱紫外吸收较弱，必须对样品进行富集浓，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处理方法采用液缩，则样品的前处理方法采用液- -液萃取法为佳；液萃取法为佳；若用若用LC-MS LC-MS 法来检测该样品，则由于法来检测该样品，则由于L

13、C-MS LC-MS 仪器仪器的灵敏度足以检测浓度为的灵敏度足以检测浓度为1 1ngng/ml /ml 以上的样品以上的样品，故，故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。直接上样即可。 例子例子 1 118 当然，用当然，用LC-MS LC-MS 法来检测阿齐霉素时，法来检测阿齐霉素时，有些分析上作者采用了液有些分析上作者采用了液- -液萃取法，也液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法来有另一些分析工作者采用了固相萃取法来处理血样，这些做法

14、虽然行得通，但显然处理血样，这些做法虽然行得通，但显然它们不但增加了样品处理的所需时间和工它们不但增加了样品处理的所需时间和工作量，而且增加了样品处理的成本，因此作量，而且增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血样处理最好采用蛋白沉淀法。阿齐霉素的血样处理最好采用蛋白沉淀法。19 蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不样品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，

15、法，考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。白法为最佳。20 如果测定的是血清中头孢拉定的浓如果测定的是血清中头孢拉定的浓度，头孢拉定为度，头孢拉定为-内酰胺类抗生素，内酰胺类抗生素，对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取。对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取。蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。法了。-具体问题具体分析具体问题具体分析 -信息，查文献信息，查文献例子例子 2 221第二节第二节 分析方法分析方法建立

16、的一般步骤建立的一般步骤 22一、分析方法的选择一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计受多种因素影响体内药物分析方法的设计受多种因素影响生物样品中的生物样品中的药物浓度药物浓度决定分析方法的决定分析方法的首首要要因素要要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、浓度低、样品量少样品量少难以通过难以通过增加取样量增加取样量提高方法灵敏度提高方法灵敏度通过通过选择适当的分析方法选择适当的分析方法适应样品分析需求。适应样品分析需求。常用分析方法的检测限度及分离能力见常用分析方法的检测限度及分离能力见表表4-14-123摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则

17、二五年三月 SFDA颁布（一）常用分析方法（1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用法（LCMS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。 从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如HPLC、GC法或LCMS、GCMS法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%的药物浓度测定可以用色谱法来完成。具体选用何种分析方法

18、应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。24二、分析方法的建立二、分析方法的建立25( (一一) )检测条件的筛选检测条件的筛选 26( (二二) )分离条件的筛选分离条件的筛选：271空白溶剂试验空白溶剂试验28对色谱分析法而言对色谱分析法而言292. 空白生物基质试验空白生物基质试验30celecoxib塞来考昔313. 模拟生物样品试验模拟生物样品试验 32对色谱分析法而言对色谱分析法而言334. 实际生物样品的测试实际生物样品的测试 34空白血浆空白血浆+标准标准溶液志愿者实际样品空白溶剂试验 多余？35第三节第三节 分析方法分析方法验证的内容与要

19、求验证的内容与要求 基于以下原因需要对建立的分析方法学进行基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：验证：1 1、生物样品量少、生物样品量少2 2、药物或活性代谢产物浓度低、药物或活性代谢产物浓度低3 3、内源性物质的干扰、内源性物质的干扰4 4、生物的个体差异较大、生物的个体差异较大36（二）方法学确证（二）方法学确证建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分方法进行充分确证确证，一般应进行以下几方面的考察：，一般应进行以下几方面

20、的考察：1、特异性、特异性(Specificity)2、标准曲线和定量范围（、标准曲线和定量范围（Calibration Curve）3、定量下限（、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）4、精密度与准确度（、精密度与准确度（Precision and Accuracy）5、样品稳定性、样品稳定性(Stability)6、提取回收率、提取回收率7、微生物学和免疫学方法确证、微生物学和免疫学方法确证8、方法学质控、方法学质控摘自摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 37 38验证步骤验证步骤 Freeze-and

21、-thaw cycle39验证的效能指标与基本要求验证的效能指标与基本要求1特异性（专属性）特异性（专属性）避免干扰避免干扰2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3准确度准确度与实际状况相符与实际状况相符4精密度精密度结果可重现结果可重现5定量限定量限达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/206稳定性稳定性确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定7提取回收率提取回收率确保检测的灵敏度确保检测的灵敏度40一、方法特异性一、方法特异性( (专属性或选择性专属性或选择性) ) 411. 1. 内源性物质的干扰内源性物质的干扰：422. 2. 代谢产物的干扰代谢产物的干扰

22、 43 对于色谱法对于色谱法至少要考察至少要考察6个不同个体的个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（于以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。效应，如离子抑制等。摘自摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 443. 3. 伍用药物的

23、干扰伍用药物的干扰454. 4. 与参比方法的相关性与参比方法的相关性 464. 4. 与参比方法的相关性与参比方法的相关性47二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围标准曲线（标准曲线（standard curve） 校正（校正（calibration curve） or 工作工作 （working curve）指生物样品中所测定药物浓度与响应（峰面积或峰高）指生物样品中所测定药物浓度与响应（峰面积或峰高）的相关性（呈比例的程度）的相关性（呈比例的程度）通常用回归分析方法所得的回归方程来评价通常用回归分析方法所得的回归方程来评价除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性除少数方法（免

24、疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式模式常用的回归分析法为最小二乘法（常用的回归分析法为最小二乘法（least squares）或）或加权最小二乘法（加权最小二乘法（weighted least squares）线性范围（线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区标准曲线的最高与最低浓度的区间间在此线性范围内，模拟生物样品的测定结果应达到试在此线性范围内，模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度验要求的精密度和准确度48二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围( (续续) )标准曲线标准曲线用模拟生物样品建立用模拟生物样品建立线性范围线性范围(不包括零点不包

25、括零点)应能覆盖全部生物样品应能覆盖全部生物样品中的药物浓度中的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备测的含药生物样品相同的生物基质制备49标准曲线的一般建立过程：标准曲线的一般建立过程： 标准系列溶液的制备标准系列溶液的制备内标溶液的制备内标溶液的制备 标准系列模拟生物样品的制备、测定标准系列模拟生物样品的制备、测定标准曲线的绘制标准曲线的绘制加权最小二乘法加权最小二乘法限度要求限度要求50标准曲线的一般建立方法标

26、准曲线的一般建立方法 51至少含至少含58个浓度点个浓度点(不包括零点，即空白不包括零点，即空白)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度等比梯度模式模式比例常数约为比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为若体内平均达峰浓度为50，其，其1/20为为2.5设定最高浓度为设定最高浓度为100，最低浓度为，最低浓度为1 (个体差异个体差异)52533. 3. 标准系列模拟生物样品的制备标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质空白生物基质( (如血浆如血浆) )加入标准系列溶液适量，涡旋混匀加入标准系列溶液适量，涡旋混匀

27、 标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，药后的达峰浓度，最低浓度应低于最低浓度应低于C Cmaxmax的的10105 5。 目的目的涵盖涵盖为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 ？先加入标准溶液先加入标准溶液 再加入空白生物基质再加入空白生物基质涡旋混匀涡旋混匀 544. 4. 标准曲线的绘制标准曲线的绘制555. 5. 加权最小二乘法加权最小二乘法 2iiiyyy2) (iiiyyw2) (iiyy561）回归方程）回归方程(y = a + b x)参数的计算参数的计算22biiiiii

28、iiiiiiixwxwwywxwyxww222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxwiiiiiwxwywba 或，22/riiiiiiiiiiwywywwywbxaw现在有专业软件57选择加权因子时选择加权因子时兼顾考虑曲线上高、中、低兼顾考虑曲线上高、中、低各浓度点的准确度，赋予低浓度点以更大的权重各浓度点的准确度，赋予低浓度点以更大的权重在实际工作中的一般方法在实际工作中的一般方法（1 1）当）当w wi i=1/(=1/(y yi i) )2 2时，则时，则（2 2）而）而y yi i与与x xi i成正比成正比（3 3）所以，令）所以，令w wi i=1/(b=1/

29、(bx xi i) )2 2=k/=k/x xi i2 2 当高浓度点测量值的准确度下降过大当高浓度点测量值的准确度下降过大低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，w wi i=k/=k/x xi i2) (iiiyyw2iiiyyy58标准曲线的标准曲线的限度要求限度要求在药代动力学或生物利用度研究中：在药代动力学或生物利用度研究中：59三、准确度三、准确度 601. 1. 测定法测定法 612. 2. 结果计算与限度要求结果计算与限度要求 ）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE62四、精密度四、精密度 631. 1. 表示方法表示方法

30、112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii64 6566(%)1001)(%)100112 XIXXnXISSIiiA）（%100(%)100 XINSSSSXINSSAtote）（）（%100)(11212 XINXXnXXIiIiinjij6768五、定量限五、定量限6970LOD TestS/N37172737475七、七、萃取萃取回收率（回收率（Extaction recovvveryExtaction recovvvery） 761 1. . 测定法测定法）（%100STAAR77782 2. . 限度要求限度要求7980818283 由于生物基质中存在

31、内源性的该物质，难以测由于生物基质中存在内源性的该物质，难以测定方法的定方法的LOQLOQ和准确度，此时可通过以下方法制备空和准确度，此时可通过以下方法制备空白生物基质：白生物基质：1 1、对生物基质进行处理、对生物基质进行处理-活性炭滤过、透析活性炭滤过、透析2 2、使用不含内源性物质的生物基质、使用不含内源性物质的生物基质周期性变化的周期性变化的内源性物质如某些激素。内源性物质如某些激素。3 3、使用替代基质、使用替代基质如兔血浆、人血清蛋白、缓冲液如兔血浆、人血清蛋白、缓冲液84出现以下情况时，分析方法需进行再评价或交互验证：出现以下情况时，分析方法需进行再评价或交互验证：1 1、改变色

32、谱条件或生物样品的处理方法样品的前处、改变色谱条件或生物样品的处理方法样品的前处理方法改变后需要对效能指标进行重新考察理方法改变后需要对效能指标进行重新考察2 2、改变生物基质、改变生物基质 不同物种的同种生物基质（大鼠血不同物种的同种生物基质（大鼠血浆浆 人血浆）、同一物种的不同生物基质（血浆人血浆）、同一物种的不同生物基质（血浆 血清）、甚至使用相同基质而使用不同抗凝剂等。血清）、甚至使用相同基质而使用不同抗凝剂等。851 1、浓度高于定量上限、浓度高于定量上限取样品用空白基质稀释，取样品用空白基质稀释，同时制备高于定量上限的同时制备高于定量上限的QCQC样品，同法稀释后测定，样品，同法稀

33、释后测定，以确认稀释的有效性。以确认稀释的有效性。2 2、浓度低于、浓度低于LOQLOQ增加生物样品的体积，使测定增加生物样品的体积，使测定液的浓度高于液的浓度高于LOQLOQ。应在相同条件下制备。应在相同条件下制备QCQC样品和增样品和增加体积后的空白生物基质进行试验，以确认方法的加体积后的空白生物基质进行试验，以确认方法的准确度、精密度和特异性符合要求准确度、精密度和特异性符合要求。86第四节第四节 体内药物分析方法体内药物分析方法应用示例应用示例 NOFNNOOH, HCl, H2O87药动学参数药动学参数8889二、分析方法设计二、分析方法设计 90 91三、实验方案三、实验方案929

34、3 9495四、分析方法验证四、分析方法验证96979899时间（d）As/Ai循环次As/Ai时间（d）As/Ai时间（h）As/Ai02.728604.359502.989203.4263102.911314.490212.978183.4350202.781924.313923.0595243.43515样品稳定性样品稳定性1006提取回收率提取回收率取空白血浆取空白血浆0.5ml，按，按“标准曲线标准曲线”项下方法项下方法制备低、中、高三个浓度制备低、中、高三个浓度(分别为分别为 0.1，0.5，2.0 g/ml)的的QC样品，并与相应浓度的未经处理的样品，并与相应浓度的未经处理的溶液比较，计算环丙沙星与内标物的提取回收率溶液比较，计算环丙沙星与内标物的提取回收率分别为：分别为： 0.1 g/ml 67.7%(RSD为为2.5%) 0.5 g/ml68.3%(RSD为为4.2%) 2.0 g/ml67.4%(RSD为为11.1%)内标物内标物64.5%(RSD为为4.8%)均大于均大于50%，且结果稳定，且结果稳定