分子生物学基础及基因检测技术课件.pptx

1、分子生物学基础及基因检测技术 基因的基本概念 人体-组织-器官-细胞-细胞核-染色体-DNA-基因 基因检测的基本原理和检测技术简介 基因芯片技术的优缺点分析和未来发展主要内容。206块骨头、650条肌肉、100多个关节3亿个肺泡，体积为米的十分之一每昼夜跳动十万次，每天排出9000升血液，血管长约9000多公里平均重1.2公斤，体积1.5立方分米，150亿个单元，耗能功率10w，信息容量1015比特大数据神奇的人体人体九大系统（Nine human body system）器官（Organ）由几种不同类型的组织联合形成的，具有一定的形态特征和一定生理机能的结构。组织（Tissue）由形态相似

2、，结构、功能相同的细胞和细胞间质联合在一起形成的细胞群叫做组织（tissue）上皮组织结缔组织肌肉组织神经组织细胞-人体结构和功能的基本单位遗传深度压缩的聚合体-染色体 等位基因，在同一基因座上、但来源不同的同一基因 单倍型，是指同一染色体区域中相互连锁的两个不同的基因位点等位基因和单倍型生物主要的遗传物质-DNA基因是有遗传效应的DNA片段Gene遗传中心法则（genetic central dogma）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNPs）：单核苷酸多态性指在基因组中不同个体的DNA序列上的单个碱基差异。同一位置上的每个碱基类型叫做一个等

3、位位点。单核苷酸多态性（SNP）甲基化（ methylation）胚胎发育早期多处于高甲基化状态甲基化（ methylation）人体四种组织：上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织细胞是人体结构和功能的基本单位染色体：由DNA和蛋白质构成基因是有遗传效应的DNA片段甲基化是调控基因表达的一种方式小结基因检测的基本原理和检测技术简介 基于构象的检测方法 测序 实时荧光PCR 以杂交为基础（基因芯片） 内切酶技术 光谱和电子信号 其他方法，如磁性纳米技术、飞行质谱等m双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法) 1970s 同位素标记，手工 1980s 荧光标记，自动 1990s 毛细管电泳m合成

4、测序法（第二代测序） 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）m单分子测序技术（第三代测序） Helicos Pacific Biosciences Oxford Nanopore 测序技术的发展历史测序费用不断降低Sanger法DNA测序的原理m双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂m在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展

5、开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。m在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、T、C和G的位置上。动画演示1.测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。2.测序反应费时费力3.测序准确度不高4.结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。一代测序技术的缺点第二代测序技术m第二代测序技术循环阵列合成测序法 新一代测序技术（Next Generation Gequencing，NGS）m代表技术为 罗氏公司

6、(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer) （2005） Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer) ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)（2007）动画演示实时荧光定量PCRp 实时荧光定量实时荧光定量 PCR ( real-time fluorogenetic quantitative PCR , RQ-PCR) 是在 PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术p 它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 , 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程 , 最后通过标准曲线对

7、未知模板进行定量分析的方法实时荧光 PCR的分类：p 标记方法：荧光标记探针（Taqman）；双链 DNA ( dsDNA) 结合染料SYBRgreenp 检测基因表达：绝对定量；相对定量p 检测SNP：ARMS-PCR；HARM扩增阻滞突变系统多聚链酶式扩增(ARMS-PCR)HRM进行SNP检测原理DNA withheterocygoteSNPPCR+ . . .TCTTTTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature高分辨率融解曲线高分辨率融解曲线(HR

8、M) 是一种分析是一种分析DNA融解曲线的新方法融解曲线的新方法.生物芯片将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA或其他样品分子（例如蛋白，因子或小分子）进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。生物芯片生物芯片被动式芯片被动式芯片主动式芯片主动式芯片基因（基因（DNA）芯片）芯片蛋白质芯片蛋白质芯片微流控芯片：微流控芯片：样品制备芯片、聚合酶链反应样品制备芯片、聚合酶链反应（PCR）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片 cDNA芯片芯片寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片组织芯片组织芯片细胞芯片细胞芯片芯片实验室：芯片实验室：样品制

9、备、试剂输送、生化反应、样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作 生物芯片分类将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通过类似于Northern，Southern的方法与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的大量信息，进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。基因芯片基因芯片优势 比较疾病状态下不同时间点基因表达的差异 对复杂疾病的鉴定 药物发现和药物毒性测试 病原微生物分析 多位

10、点SNP分析 人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，用于分子诊断是临床研究中一种新的、强有力的分子工具。 遗传病相关基因的定位 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 耐药菌株和药敏检测 疾病的诊断和治疗DNA芯片微流控芯片（microfluidic device）微流控是指在一个微小系统中对微量液体进行控制操作。最为人们熟知的微流控技术的应用是喷墨打印。 微流控芯片（第二代生物芯片）是微阵列芯片（第一代生物芯片）的延伸 微阵列芯片具有快速，高信息量的优点，但至今广泛使用上仍受限制，除价格因素外（只有建立在大样本量的基础上才能够适当降低成本），样品制备的复杂繁琐是妨碍其广

11、泛使用的主要原因。 微流控芯片，把前置处理过程微缩在芯片上，目的是把实验微型化，最终制成芯片实验室（lab-on-a-chip）有了它，就可以告别步骤繁复，仪器杂乱的实验室。微流控芯片（microfluidic device） 进一步提高探针阵列的集成度 。 提高检测的灵敏度和特异性。 高自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低。 高稳定性。 研制新的应用芯片。 研制芯片新检测系统和分析软件，以充分利用生物信息。 芯片技术将与其它技术结合使用，如基因芯片PCR、纳米芯片 。 不同生物芯片间综合应用，如蛋白质芯片与基因芯片间相互作用等，可用于了解蛋白质与基因间相互作用的关系。 基因芯片技术未来方

12、向 变性高效液相色谱分析荧光原位杂交一代测序等位基因特异性PCR二代测序荧光PCR转录介导扩增法单链构象多态性PCR多重PCR巢式PCR限制性片段长度多态性基因芯片重组酶介导扩增法重组酶介导扩增法方法选择的影响因素费用费用 目的用途目的用途 特异性特异性 标本类型标本类型方法选择方法选择 灵敏度灵敏度方法 PCR 测序 芯片背景针对科研需求:低拷贝基因的扩增满足科研需求:全基因组未知序列测定满足检测需求:已知序列的再验证特点高灵敏度广泛用于临检标准化成熟灵敏度适中临检叫停需规范标准化灵敏度适中已用于临检标准化趋于成熟局限影响因素多不够稳定技术复杂时间长、步骤多少量样本成本高序列存在伦理障碍PCR前处理抵消了优势（FDA已批准去PCR芯片产品上市）临检低拷贝、少量基因指标定性、定量检测适合罕见病的病因筛查、未知序列、全基因组序列测定适合药物、肿瘤、病原基因组多个已知位点的高通量、自动化检测备注低门槛、高竞争大量测序设备需要市场出路未来个体化检验的主流总结谢谢！