2021推荐蛋白质组学研究方法0课件.ppt

1、蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法0中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室2 2 第一节第一节 概述概述 中英联合实验室中英联合实验室3 3 1.1. 蛋白质组学比基因组学研究复杂蛋白质组学比基因组学研究复杂蛋白质数目大于基因组数目，人类基因万左蛋白质数目大于基因组数目，人类基因万左右，蛋白质右，蛋白质1010万万蛋白质是动态的蛋白质是动态的4 4种核苷酸种核苷酸-DNA; 20-DNA; 20氨基酸氨基酸- -蛋白质蛋白质蛋白质不能用蛋白质不能用PCRPCR扩增扩增蛋白质不能自动化测序蛋白质不能自动化测序中英联合实验室中英联合实验室4 4DNA分析（分析（cDNA Mic

2、roarray）与蛋白质分析（）与蛋白质分析（2-DE-MS）方法的比较）方法的比较DNA蛋白质蛋白质检测水平检测水平/ /灵敏度灵敏度 DNADNA可用可用PCRPCR扩增扩增 蛋白质无法被扩增蛋白质无法被扩增 检测极限约为检测极限约为30 30 copy/transcript copy/transcript检测方法检测方法 高度特异性高度特异性 非特异性非特异性 DNA DNA与互补与互补DNA/RNADNA/RNA的杂交能力的杂交能力 蛋白质可以用非特异的方法染色或用较特异蛋白质可以用非特异的方法染色或用较特异 使使DNADNA和容易固定化在靶上并用和容易固定化在靶上并用 的方法如抗体检

3、测的方法如抗体检测 荧光探针检测，可用高密度列阵荧光探针检测，可用高密度列阵 荧光扫描仪荧光扫描仪 分子的稳定相分子的稳定相 DNADNA是非常稳定的，即使提高温度是非常稳定的，即使提高温度 蛋白质在变性下将丧失天然功能蛋白质在变性下将丧失天然功能 下也不失去生物活性下也不失去生物活性重复性重复性 重复性好重复性好 重复性不好重复性不好 将将DNADNA固定化在表面已经是成熟的固定化在表面已经是成熟的 由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性 技术，加之技术，加之DNADNA有固有的稳定性，方有固有的稳定性，方 需格外关注需格外关注 法的重复性较好法的重

4、复性较好消耗消耗 初始的投入较大，但短期内得到的初始的投入较大，但短期内得到的 目前蛋白质分析方法依赖昂贵的仪器设备目前蛋白质分析方法依赖昂贵的仪器设备 的数据相当大的数据相当大专业化专业化 方法已经相当标准方法已经相当标准 分析较难，大部分工作需受过专门训练的人分析较难，大部分工作需受过专门训练的人 来操作来操作时间时间/ /自动化自动化 已成为高通量的扫面技术已成为高通量的扫面技术 目前还达不到工业化需求的高通量目前还达不到工业化需求的高通量翻译后修饰翻译后修饰 无法研究无法研究 只能用此方法研究只能用此方法研究 动态动态 5 5个数量级个数量级 7-127-12个数量级个数量级 中英联合

5、实验室中英联合实验室5 5蛋白质分析技术的发展蛋白质分析技术的发展2 2D-PAGE, IPG, 2D-D-PAGE, IPG, 2D-液相色谱液相色谱图像分析与数据处理技术图像分析与数据处理技术生物质谱技术（生物质谱技术（MALDI-TOF-MS, ESI-MS)MALDI-TOF-MS, ESI-MS)MudPITMudPIT（多维蛋白质鉴定技术）多维蛋白质鉴定技术）ICATICAT（同位素编码亲和标签技术）同位素编码亲和标签技术）双色荧光技术双色荧光技术酵母双杂交酵母双杂交Protein chipProtein chip中英联合实验室中英联合实验室 样品样品组织、细胞、体液组织、细胞、体

6、液胶上原位酶切胶上原位酶切2-DEMALD/TOF/MS肽指纹图谱肽指纹图谱蛋白质鉴定蛋白质鉴定ESI/MS/MSPST/MALD/ TOF/MS图像分析，数据处理图像分析，数据处理电转印到膜上电转印到膜上氨基酸组成氨基酸组成N端序列端序列Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析肽混合物肽混合物肽序列标签肽序列标签数据库检索数据库检索免疫组化免疫组化蛋白定位蛋白定位蛋白组数据库蛋白组数据库寡核苷酸合成寡核苷酸合成基因基因蛋白实验蛋白实验蛋白活力蛋白活力肽合成肽合成抗体抗体 蛋白质组学蛋白质组学 分析流程分析流程中英联合实验室中英联合实验室7 7第二节第二节 大规模的蛋白质分离技术大规模的蛋白质分

7、离技术中英联合实验室中英联合实验室8 8一、二维凝胶电泳技术一、二维凝胶电泳技术（2 2D-PAGE )D-PAGE )IEF or IPGSDS中英联合实验室中英联合实验室9 9l 1975 1975 年由年由O FarrellO Farrell提出的。提出的。l 是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与 展示的分离技术。展示的分离技术。l 其原理是在相互垂直的两个方向上，分别其原理是在相互垂直的两个方向上，分别 基于蛋白质不同的等电点和分子量将蛋白基于蛋白质不同的等电点和分子量将蛋白 质分离开。质分离开。 20 20世纪世纪8080年代初出现固相化年代初出现

8、固相化pHpH梯度梯度 （IPG) (IPG) (第一相等点聚焦）。第一相等点聚焦）。 不足之处：膜蛋白，碱性蛋白，低丰度蛋白分不足之处：膜蛋白，碱性蛋白，低丰度蛋白分离离 困难。困难。 解决办法解决办法 ？中英联合实验室中英联合实验室1010低丰度蛋白：低丰度蛋白：窄范围窄范围pH, pH, 加大上样量，除去高丰度蛋白。加大上样量，除去高丰度蛋白。BeforeAfter removalOf albumin中英联合实验室中英联合实验室11112-DE analysis of non-fractionated soybean leaf proteins (Left) and Ca2+/phyta

9、te fractionated soybean leaf proteins (Right). (Krishnanet al. (A rapid method for depletion of Rubisco from soybean (Glycine max) leaf for proteomic analysis of lower abundance proteins . Phytochem.2009)中英联合实验室中英联合实验室1212PEG fractionation: (A) 1-D SDS-PAGE of unfractionated and fractionated samples

10、; (B) 2-DE PAGE maps of Total extracted proteins; (CE) 2-DE maps of PEG fractions: (C) F1 PEG fraction; (D) F2 PEG fraction; (E) F3 PEG fraction. Electrophoresis 2009, 30, 15941602中英联合实验室中英联合实验室1313膜蛋白：膜蛋白：分步提取法。分步提取法。CHAPS: zwitterionic detergentCA: carrier ampholyteTBP: Tributyl phosphineSB3-10: s

11、ulfobetaine (detergent)中英联合实验室中英联合实验室1414pH 4 pH 5pH 5 pH 6pH 4 pH 9碱性蛋白：碱性蛋白：扩大扩大pHpH范围（范围（IPG pH12)IPG pH12)中英联合实验室中英联合实验室1515 高通量与自动化高通量与自动化2 2D-PAGE/MSD-PAGE/MS为基础的蛋白质组技术体系自为基础的蛋白质组技术体系自动化主要集中在动化主要集中在2 2D-PAGED-PAGE后的样品处理后的样品处理。中英联合实验室中英联合实验室1616蛋白质识别系统的自动化2-DE, 2-DE, 染色，凝胶分析染色，凝胶分析胶上蛋白质自动切割胶上蛋白

12、质自动切割 置于置于9696或或384384孔板孔板 自动蛋白酶解，多肽自动蛋白酶解，多肽可回收，点样于可回收，点样于MSMS样品靶样品靶 自动自动MSMS样品分析样品分析 自动采集数据自动采集数据数据库数据库 检索，蛋白鉴定检索，蛋白鉴定 中英联合实验室中英联合实验室17171. 1. 实验设计，采样量实验设计，采样量2. 2. 重复性问题重复性问题3. 3. 动态范围动态范围4. 4. 蛋白质的丢失蛋白质的丢失5. 5. 通量与自动化问题通量与自动化问题2 2DPAGE-DPAGE-质谱为基础的蛋白质组学方法的局限性质谱为基础的蛋白质组学方法的局限性中英联合实验室中英联合实验室1818二、

13、色谱二、色谱质谱技术质谱技术1 1二维色谱二维色谱串联质谱技术（串联质谱技术（2 2D-HPLC-MS-MS)D-HPLC-MS-MS)中英联合实验室中英联合实验室1919中英联合实验室中英联合实验室20202-DE2-DE与与2D-HPLC2D-HPLC的比较的比较 优点优点 缺点缺点2-DE2-DE 分辨率高，分辨率高，1000 1000 费时，费力费时，费力 可得到等电点、分子量的信息可得到等电点、分子量的信息 不已自动化不已自动化 可得到蛋白质表达谱可得到蛋白质表达谱 疏水、酸性、碱性、疏水、酸性、碱性、10 kDa10 kDa、 可平行多个胶可平行多个胶 1000 kDa1000 k

14、Da的蛋白质易丢失的蛋白质易丢失 样品载样量受限制样品载样量受限制2D-HPLC2D-HPLC 可分离各种蛋白质可分离各种蛋白质 尚未实现平行操作尚未实现平行操作 易于自动化易于自动化 不易得到蛋白质表达谱不易得到蛋白质表达谱 样品在液相样品在液相 分辨率不高分辨率不高 流分易收集流分易收集 可做样品制备和收集可做样品制备和收集中英联合实验室中英联合实验室2121采用二维色谱采用二维色谱串联质谱技术可以对串联质谱技术可以对 蛋白质混合物进行直接分离与鉴定蛋白质混合物进行直接分离与鉴定中英联合实验室中英联合实验室22222同位素标记同位素标记亲和色谱亲和色谱质谱技术质谱技术定量蛋白质组学分析技术

15、定量蛋白质组学分析技术Isotope-coded affinity tag (ICAT) 中英联合实验室中英联合实验室2323三、一维电泳三、一维电泳( (色谱色谱)质谱技术质谱技术中英联合实验室中英联合实验室2424 18861886年年GoldsteinGoldstein发明早期质谱仪的离子源，发明早期质谱仪的离子源，1942 1942 年第一台商品化质谱仪出现年第一台商品化质谱仪出现分析小分子化合物。分析小分子化合物。 20 20世纪世纪8080年代末期的两项软电离质谱技术年代末期的两项软电离质谱技术电喷电喷 雾电离质谱（雾电离质谱（ESI-MS)ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞和

16、基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱行时间质谱( (MALDI-TOF-MS)MALDI-TOF-MS)分析蛋白质。分析蛋白质。第三节第三节 生物质谱蛋白质鉴定技术生物质谱蛋白质鉴定技术MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:高通量，肽指纹图谱，须数据库匹配高通量，肽指纹图谱，须数据库匹配。ESI-MS:ESI-MS:肽序列标签，特异性高，混合肽测定，操作繁琐。肽序列标签，特异性高，混合肽测定，操作繁琐。 新生物质谱技术新生物质谱技术: : MALDI QqTOF-MS, MALDITOF-TOF-MSMALDI QqTOF-MS, MALDITOF-TOF-MS中英联合实验室中英联

17、合实验室2525 Gel-based proteomics The typical flow of gel-based proteomics (2DE & MS)l Sample preparationl Protein Separation First-dimension isoelectric focusing (IEF) Second-dimension SDS-PAGEl Visualization & evaluationl Expression analysisl Protein identification by MS中英联合实验室中英联合实验室2626Thank You14.

18、不要想太多，定时清除消极思想。15. 学会忘记痛苦，为阳光记忆腾出空间。1. 肉体是精神居住的花园，意志则是这个花园的园丁。意志既能使肉体“贫瘠”下去，又能用勤劳使它“肥沃”起来。13. 因为爱心，流浪的人们才能重返家园;因为爱心，疲惫的灵魂才能活力如初。渴望爱心，如同星光渴望彼此辉映;渴望爱心，如同世纪之歌渴望永远被唱下去。11. 虽然现实生活中，不是所有的梦想都能开花结果，也不是所有的人都能梦想成真。但每一个梦想都是绚烂多姿，每一个人都因追逐梦想而生活得更加精彩。4. 要成功，先发疯，头脑简单向前冲。10、生命对某些人来说是美丽的，这些人的一生都为某个目标而奋斗。6. 有时候把自己长项藏起

19、来，弱项暴露出来没关系，这是我的建议。13. 知难而上，奋发图强，是竞争的作用;知难而退消极颓唐，也是竞争的作用。11. 生命中越珍贵的东西越爱迟到。9. 决定可以克服不可能的事情。13. 世事忙忙如水流，休将名利挂心头。粗茶淡饭随缘过，富贵荣华莫强求。6、只有一条路不能选择那就是放弃的路;只有一条路不能拒绝那就是成长的路。18. 目标的坚定是性格中最必要的力量源泉之一，也是成功的利器之一。没有它，天才也会在矛盾无定的迷径中徒劳无功。10. 平生不做皱眉事，世上应无切齿人。13. 顾客后还有顾客，服务的开始才是销售的开始。5、拥有梦想只是一种智力，实现梦想才是一种能力。1. 过去的事情是无法挽回的。聪明人对现在与未来的事惟恐应付不暇，对既往的事岂能再去计较。6. 热情是一种巨大的力量，从心灵内部迸发而出，激励我们发挥出无穷的智慧和活力;热情是一根强大的支柱，无论面临怎样的困境，总能催生我们乐观的斗志和顽强的毅力没有热情，生命的天空就没的色彩。4. 感谢你的支持，不论今天有多挫折，我仍会勇敢地活下去。5. 对于不可改变的事实，除了认命以外，没有更好的办法了。3. 贫穷是不需要计划的，致富才需要一个周密的计划并去实践它。