分子生物学常用实验方法与基本仪器操作课件.ppt

1、分子生物学常用实验方法与基本仪器操作分子生物学常用实验方法与基本仪器操作 分子生物学发展简史分子生物学发展简史近半个世纪以来近半个世纪以来Nobel medal Half a pound of 23-karal gold. 2.5 inches across分子生物学发展简史分子生物学发展简史近半个世纪以来近半个世纪以来分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.11.1支撑学科的掘起支撑学科的掘起 Matthias Schleiden Theodor Schwann生物体由细胞组成 所有组织的最基本单元-形状相似，高度分化的细胞 细胞的发生与形成是生物界普遍和永久的规律Cytology分子生物学

2、发展简史分子生物学发展简史遗传因子假说 (Hypothesis of the inherited factor G. J. Mendel 1866. ) 生物性状由遗传因子控制亲代传给子代的是遗传因子(A,a.) 遗传因子在体细胞内成双(AA,aa) 在生殖细胞内为单（A,a） 杂合子体细胞内具有成双的遗传因子(Aa) 等位的遗传因子独立分离 非等位遗传因子间自由组合地分配到配子中分子生物学发展简史分子生物学发展简史 For his discoveries concerning the role played by the Chromosome in heredity, demonstrate

3、d that genes are on the chromosome 1933年，获得诺贝尔生物学奖Thomas Hunt Morgan分子生物学发展简史分子生物学发展简史 早期的遗传学家们研究基因Forward Genetics ：在不知基因化学本质前提下分析突变体在世代间的传递规律研究基因特性和染色体定位描述基因突然和染色体变异效应 二十世纪中叶遗传学家们不再满足于基因的抽象观念，开始聚焦提示基因的本质和作用机制分子生物学发展简史分子生物学发展简史时间时间得主得主得奖原因得奖原因1946年詹姆斯B萨姆纳发现了酶可以结晶1946年约翰霍华德诺思罗普温德尔梅雷迪思斯坦利制备了高纯度的酶和病毒蛋

4、白质1958年弗雷德里克桑格对蛋白质结构组成的研究，特别是对胰岛素的研究1958年乔舒亚莱德伯格发现细菌遗传物质的基因重组和组织1959年阿瑟科恩伯格发现核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成机制塞韦罗奥乔亚研究遗传物质研究遗传物质-基因的本质，理解基因调控生化代谢过程基因的本质，理解基因调控生化代谢过程分子生物学分子生物学分子生物学简史分子生物学简史1.2 分子生物学第一个重要发现分子生物学第一个重要发现George Beadle & Edward Tatum1941年，提出“One Gene- One Enzyme”假说，说明基因的生化作用本质是控制酶的合成获得1958年诺贝尔生物学奖分子生物学

5、发展简史分子生物学发展简史Oswald Avery1.3 DNA是遗传物质是遗传物质1928-1944年的肺炎链球菌遗传转化研究证明DNA是转化因子第一个动摇了“蛋白质是基因”的理念，奠定了“DNA是遗传物质”的理论基础。1952年，M.Delbruck & S.E. Luria & A.Hershey对噬菌体繁殖过程展开深入研究，确定DNA是主要遗传物质。获得1969年诺贝尔生物学奖。HrersheyDelbruckLuria分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.4 DNA1.4 DNA双螺旋结构的揭示双螺旋结构的揭示 Francis Crick James Watson1953，DNA

6、Double Helix model 1962，NP分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.5 破译遗传密码 R. Holley H.G. Khorana M. Nirenberg 破解遗传密码并阐释其在蛋白质合成中的作用1968 NP分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.6 mRNA的发现和operon的提出基因通过RNA严格地控制着蛋白质的合成命名为信使RNA（mRNA）暗示了“三联体遗传密码”以外的“空间调控密码”的存在，为分子生物学的发展奠定了基础1965 NPF. Jacob & J. Monod & A. Lwoff 分子生物学发展简史分子生物学发展简史中心法则：中心法则：从DN

7、A流向DNA(DNA自我复制);从DNA流向RNA，进而流向蛋白质(转录和翻译);从RNA流向RNA(RNA自我复制);从RNA流向DNA(逆转录)1975 NP分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.8 学科互促共进DNA分子的克隆技术基因的定点诱变技术PCR的DNA扩增技术细胞与组织培养技术使分子生物学从观察性-验证性的科学发展成干涉性-创造性的科学分子生物学发展简史分子生物学发展简史 Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith 发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用1978 NP分子生物学发展简史分子生物学发展简史对核酸中DNA碱基序列

8、的确定方法The Nobel Prize in Chemistry 1980Walter Gilbert Frederick Sanger Paul Burg1958 NP：胰岛素结构分子生物学发展简史分子生物学发展简史Kary B. Mullis 发展了以DNA为基础的化学研究方法，开发了聚合酶链锁反应（PCR）对分子生物学家研究工作的影响程度超过了其他任何技术，它的应用领域几乎超过了其他任何技术。1993 NP in Chemistry分子生物学发展简史分子生物学发展简史1.9 现代分子生物学现代分子生物学研究对象的变换研究策略的创新研究内容的拓展分子生物学发展简史分子生物学发展简史研究对

9、象的变换研究对象的变换以果蝇，豌豆为揭示生命奥秘的材料系统 高等真核生物宏观与微观的结合40年代以病毒，细菌原核生物系统为试材，Cistron，one gene one enzyme，operon, 等新理论不断被发现，新概念不断被提出，生物学开始腾飞. 1969 Nobel Delbruck 1969 Nobe medall HersheyLuria 分子生物学发展简史分子生物学发展简史时间时间得主得主得奖原因得奖原因1983巴巴拉麦克林托克发现可移动的遗传元素1989悉尼奥尔特曼&托马斯切赫发现了RNA的催化性质1993理察罗伯茨&菲利普夏普发现断裂基因1995爱德华路易斯&克里斯汀纽斯林

10、-沃尔哈德&艾瑞克威斯乔斯发现早期胚胎发育中的遗传调控机理1997史坦利布鲁希纳发现朊病毒传染的一种新的生物学原理2001利兰哈特韦尔&蒂姆亨特&保罗纳斯发现细胞周期的关键调节因子2002悉尼布伦纳&H罗伯特霍维茨&约翰E苏尔斯顿发现器官发育和细胞程序性死亡的遗传调控机理2006安德鲁法厄&克雷格梅洛发现了RNA干扰双链RNA引发的沉默现象分子生物学发展简史分子生物学发展简史研究策略的创新（研究策略的创新（ Genomics ）1990. 10. 1. HGP 20世纪Reductionism21世纪Holism分子生物学发展简史分子生物学发展简史Gene + ome+ ics Transcr

11、iptome Proteome Metabolome Phenotypome揭示生命现象的本揭示生命现象的本质质分子生物学发展简史分子生物学发展简史研究内容的拓展研究内容的拓展19401965分子生物学的核心问题：DNA作为遗传物质的三大基本属性问题得以基本的阐明分子生物学发展史上划了个阶段性的句号分子生物学研究在已建立的基本理论框架中进行全方位的“解谜”分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1. 高压灭菌分子生物学的前期准备高压灭菌分子生物学的前期准备灭菌灭菌(sterilization) 杀灭物体上所有微生物的方法。因此，灭菌比消毒要求高，包括杀灭病原微生物和非病原微生物

12、、细菌的繁殖体和芽胞。无菌无菌(asepsis) 不含活菌的意思。防止细菌进入人体或其它物品的操作技术，称为无菌操作。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法一、物理消毒灭菌法一、物理消毒灭菌法（一）热力灭菌法1.干热灭菌法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。原理是加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。（1）焚烧：被污染的纸张、实验 室有传染性的动物尸体、无经济价值的物品可以烧掉。 （2）烧灼：火焰灼烧适用于接种环、 接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂 布用玻璃棒。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.

13、1 灭菌方法灭菌方法（3）干烤：干烤灭菌法需在干烤箱进行，靠热空气进行灭菌。这种方法适用于玻璃器皿、金属器械以及不能遇水的油脂、凡士林等灭菌。灭菌时一般加热至160170 2小时可达到灭菌的目的。在装满物品的干烤箱内，不同部位的温度差可达3040，故温箱内最好装有鼓风机使温度均匀。箱内物品不宜装得太多，以免影响空气的流通。（4）红外线：红外线烤箱，供小件器械(镊子、剪刀等)以及玻璃注射器等迅速灭菌用。注意事项：注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在）温度控制在180；3）物品不能太挤；）物品不能太挤；4）温度降至）温度降至70

14、时才开箱门。时才开箱门。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法（2）煮沸消毒法：煮沸5分钟，可杀灭所有的细菌繁殖体。但杀死芽胞则需一至数小时。如在水中加入1%碳酸钠即可提高沸点，增强杀灭芽胞作用，同时又可防止金属器械生锈。如水中加25%石炭酸，则1015分钟后可破坏芽胞，所以许多医疗器械如手术刀、剪、镊子医疗器械如手术刀、剪、镊子、胶管、注射器等，常用煮沸消毒。、胶管、注射器等，常用煮沸消毒。2. 湿热灭菌法: 原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固。蛋白质凝固时所需温度与其含水量成反比关系，即蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在

15、。湿热的穿透力比干热大。所以效果比同温度下干热好所以效果比同温度下干热好。（1）巴氏消毒法(pasteurization)：常用于牛奶常用于牛奶和酒类等物品的消毒和酒类等物品的消毒。具体的消毒方法有两种：一是以61.162.8消毒30分钟；另一方法是以71.7，消毒1530秒钟。 分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法（3）流通蒸气消毒法：用阿诺氏灭菌器或普通蒸气笼进行。因此在正常大气压下，故温度不会超过100。普通细菌的繁殖体1530分钟可杀死。但芽胞不易消灭。（4）间歇灭菌法：有些物质不能加热至100以上，例如含血清的培养基等，为了消灭其中的细菌芽

16、胞，须用间歇灭菌法。方法是用阿诺灭菌器或用蒸笼加热100维持30分钟，每天进行一次，连续三天。第一次加热后，细菌的繁殖体即被杀灭，而芽胞还能存活，为了使芽胞发芽成繁殖体，将被灭菌的物品取出放在室温37温箱内过夜，第二天再加热一次，则可杀死由芽胞生成的繁殖体。为了达到彻底灭菌，照上法再进行第三次加热，这样所有的芽胞将被杀灭。应用间歇灭菌法，在间歇期必须提供芽胞发芽所需条件。（5）高压蒸气灭菌法：设备：高压灭菌器高压灭菌器 时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 适用于培养基等的灭菌，在1.05kg/cm2蒸气压下，温度达121.3，维持1520分钟，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。高

17、压蒸气灭菌器就是根据这一原理制成的，常用于一般培养基、生理盐水、手术敷料、工作服、橡胶物品等耐高温、耐湿热等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌灭菌方法方法杀灭几类主要微生物的湿热条件微生物营养细胞孢子或芽孢酵母菌50-60，5分钟70-80，5分钟霉菌62，30分钟80，30分钟细菌 （中温细菌）50-70，10分钟2-800分钟，100；或 120，5-12分钟病毒60，30分钟分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法(二)电磁波辐射杀菌法1. 紫外线：原理：紫外线波长在200300

18、nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；这与DNA的吸收光谱范围一致。缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。紫外线释放的能量较低，故穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线。应用：只能用于无菌操作台的空气消毒，或用于不耐热物品的表面消毒。 注意事项：杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛有损伤作用，使用时应注意防护。2. 电离辐射：包括高速电子、X射线和射线等。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于产生游离基，破坏DNA。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法(三)滤过除菌法：是用物理阻留的方法将

19、液体或空气中的细菌除去。所用的器具是滤菌器(filter)。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，而大于其孔经的细菌等颗粒不能通过。 滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素，以及空气等的除菌。 目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，另一类是滤膜。 滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。 滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。 过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。注意事项： 1、压力适当； 2、无菌条件下进行； 3、防止渗透现象。 分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.1 灭菌方法灭菌方法 我

20、们来看一下滤膜灭菌是如何工作的。如下图所示，在一个漏斗形容器上部放置数片滤膜。右图是整个过滤系统。待除菌的液体装在三角瓶中（1），用蠕动泵（2）将液体抽到过滤器（3）内，滤过的液体进入事先灭菌的瓶子中。如果是灭菌少量液体，可以采用一种简单的的滤器。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.2 常用灭菌设备常用灭菌设备 凡耐高温的普通培养基、凡耐高温的普通培养基、药品、耗材等，均可用药品、耗材等，均可用此法灭菌。为保证灭菌此法灭菌。为保证灭菌效果和安全，器内要加效果和安全，器内要加入足量的水，装入的物入足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必品不要过挤，冷空气必须排尽，注意压力表

21、的须排尽，注意压力表的工作情况，防止压力表工作情况，防止压力表失灵而造成事故。失灵而造成事故。手提式高压蒸汽灭菌器手提式高压蒸汽灭菌器 分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.2 常用灭菌设备常用灭菌设备 干烤箱是用两层金属板制成的方形干烤箱是用两层金属板制成的方形箱，中间充满石棉，箱底有热源箱，中间充满石棉，箱底有热源( (电电炉炉) )，并附有温度计和自动温度调节，并附有温度计和自动温度调节器。灭菌时，打开通气口，加热到器。灭菌时，打开通气口，加热到8080时，关闭通气口，待温度上升。时，关闭通气口，待温度上升。到到160-170160-170时，保持时，保持2h2h。

22、最高温度。最高温度不得超过不得超过180180，超过，超过180180棉塞和棉塞和包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度下降下降4040以下，再开箱取物。否则，以下，再开箱取物。否则，冷空气突然进入，玻璃器材会炸裂。冷空气突然进入，玻璃器材会炸裂。干烤箱干烤箱 耐高温的玻璃器材、瓷器等常用此法灭菌，如培养耐高温的玻璃器材、瓷器等常用此法灭菌，如培养细菌用的试管、平皿、吸管等。细菌用的试管、平皿、吸管等。注意：注意：1 1）玻璃器皿不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌）玻璃器皿不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。中容易炸裂。2 2）物品不能堆得太满、太紧）物品不能堆

23、得太满、太紧 , , 以免影响灭菌效果以免影响灭菌效果。3 3）禁放易燃易焦物品，不得充当温箱使用。）禁放易燃易焦物品，不得充当温箱使用。4 4）玻璃吸管和玻璃平皿等应放入金属筒内，再放入）玻璃吸管和玻璃平皿等应放入金属筒内，再放入干烤箱内灭菌。干烤箱内灭菌。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器1.2 常用灭菌设备常用灭菌设备 高压灭菌器是一种用于实验室实验、灭菌或烧煮的高压加热蒸气作用的容器。电动锁系统：仅用触摸控制器就可以轻易和安全地开启箱盖。安全双向检测联锁装置：通过检测内压力和箱内温度来锁住箱盖， 确保使用时具有更大的安全性。双向传感系统监控空气排除状态：为了避免残

24、留空气影响到灭菌结果.自动排气装置：采用最新的自动排除蒸汽的装置以达到不用沸腾就能对液体基质进行灭菌； 在灭菌完成后，可以预先设定速率逐渐地释放蒸汽。琼脂处理方法：允许使用者更大幅度地加快融化琼脂或对箱内进行预热。自动编排启动程序：内置定时器可设定一段时间程序， 以使高压灭菌器自动启动一个灭菌周期（最长可维持一个星期）。记忆（储存）支持系统：可以改变各种参数（如灭菌、排气、加热等参数）， 且一旦发生改变（甚至发生停电故障）上述参数仍能被保留下来。全自动电子高压灭菌锅全自动电子高压灭菌锅 HV系列系列分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器高压灭菌器使用的注意事项高压灭菌器使用的

25、注意事项一不能使用此高压蒸汽灭菌器消毒不能使用此高压蒸汽灭菌器消毒任何有破坏性材料和含碱金属成份的物质任何有破坏性材料和含碱金属成份的物质。消毒这些物品将会导致爆炸。消毒这些物品将会导致爆炸或腐蚀内胆和内部管道，以及破坏垫圈。或腐蚀内胆和内部管道，以及破坏垫圈。危险物品清单如下： 1.爆炸物质 乙二醇二硝酸酯（硝化甘醇），硝酸甘油，硝化纤维素（硝化纤维素滤器）和所有含硝酸根的酯类。 三硝基苯，黄色炸药，苦味酸和所有易燃易爆的硝基 过乙酸，甲烷基，乙基，甲醇，过氧化氢， 过氧化物，苯甲酰，苯甲酰基及有机过氧化物。2.可燃性物质 金属锂、钾、钠、黄磷、磷、硫化物、红磷。 明胶、碳化钙（电石）、氧化

26、钙（石灰），镁粉，连二亚硫酸钠（保险粉）。3.氧化剂氯化钾，氯化钠，氯化铵和其他氯化物。（粉剂） 高氯酸钾，高氯酸钠，高氯酸铵和其他高氯化物。硝酸钾，硝酸钠，硝酸铵和其他硝酸物。过氧化钾，过氧化钠，过氧化钡和其他无机过氧化物。亚氯酸钠和其他亚氯化物，次氯酸钙和其他次氯酸物。4.易燃物质 二乙醚，醚，汽油，乙醛（醋醛），氧化丙稀，环氧丙烷，二硫化碳,甲醇，乙醇，二甲苯，苄基， 乙酸苄酯，灯油，火油，汽油，异戊醇，乙酸（醋酸），其他燃点在30 65 之间的类似物质.5.易燃的气体（氢气，乙炔，次乙基，甲烷）乙烷，丙烷，丁烷和其他在15 及一个大气压下的气体。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实

27、验常用方法与仪器高压灭菌器使用的注意事项高压灭菌器使用的注意事项二.含有盐分的液体漏出或溢出时，一定要及时擦干净，沿着盖子的密封圈要彻底擦干，否则会腐蚀容器和管道。三.当灭菌室有压力时，联锁手柄不能拉开，不可强制开门。在打开盖子前，确认压力已归于“0/npa”以下。四.绝对不许擅自改造这个产品。五.不要在爆炸性气体附近使用该仪器。六.不要随意去动电源线，不要把重物压在电源线上，损坏的电线或金属丝暴露会导致断电或着火。七.除蒸馏水外，不要倒任何液体于容器内。八.不要使用此高压蒸汽灭菌器用于其他目的的消毒和高压未溶解的琼脂。（粉剂）九.检查盖子的垫圈有无异物粘连，如有异物要及时清除，否则会导致蒸汽

28、泄漏。十.请使用配套的工具，不要使用其他篮筐于灭菌器内。十一.灭菌结束后，请在70以下拿出，高压后取物品时注意烫伤。十二.如有异常发生（有声音发出，闻到气味，冒烟），请立即切断电源。联系工程师，排除异常后再 继续使用。十三.移动此仪器请将盖子锁上。移动盖子时，不要拉盖子的手柄，否则盖子会变形，难以盖严。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器高压灭菌器使用的注意事项高压灭菌器使用的注意事项十四十四. .特别注意特别注意：1.灭菌器应由经过培训合格的人员操作。2.不能完全依靠自动水位保护，应经常注意水位，以免烧坏电热管。“3个水位要注意”!3.每周在夹层有压力时拉动安全阀手柄数次

29、，以确保安全阀工作正常。4.每日班后将灭菌器的置物板拿开，用布抹干灭菌室，保持灭菌室干燥。5.每日班后将蒸汽发生器内的水带压力排放完，以减少水垢。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.DNA基本操作技术基本操作技术核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术实时定量实时定量PCR基因组基因组DNA文库构建文库构建分子生物学实验常用实验方法分子生物学实验常用实验方法2.1 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术1.电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。 2.电泳基本原理3.影响电泳

30、速度的主要因素 电场强度、溶液的pH值、溶液离子强度、电渗现象、温度的影响、支持物的影响分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器操作注意操作注意4.3 凝胶电泳的简介凝胶电泳的简介 电泳的分类电泳的分类3.3.分类分类 3.1 3.1 按使用按使用目的目的命名，如：命名，如： 核酸电泳核酸电泳 血清蛋白电泳血清蛋白电泳 制备电泳制备电泳 DNADNA测序电泳测序电泳3.2 3.2 按按分离的原理分离的原理区分区分： 区带电泳区带电泳(zone EP(zone EP，ZEP)ZEP) 移界电泳移界电泳(moving boundary EP(moving boundary EP，M

31、BEP)MBEP) 等速电泳等速电泳(isotachophoresis(isotachophoresis，ITP)ITP) 等电聚焦等电聚焦(isoelectric cusing(isoelectric cusing，IEF)IEF) 3.3 3.3 按按有无固体支持物有无固体支持物区分：根据电泳是在溶液中进区分：根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，分为行还是在固体支持物上进行，分为自由电泳和支持物电自由电泳和支持物电泳泳两大类。两大类。 3.3.1 3.3.1 按按支持介质支持介质不同划分，如：不同划分，如： 纸电泳纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶

32、电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3.3.2 3.3.2 按按支持介质形状支持介质形状不同划分，如：不同划分，如： 薄层电泳薄层电泳 水平电泳水平电泳 柱电泳柱电泳 垂直电泳垂直电泳分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器毛细管电泳技术毛细管电泳技术传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。19671967年年HjertenHjerten最先提出在直径为最先提出在直径为3mm3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Capillary Zone Electro-ph

33、oresis, CZEZone Electro-phoresis, CZE）。）。 但他没有完全克服传统电泳的弊端。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（现在所说的毛细管电泳技术（CECE）是由）是由JorgensonJorgenson和和LukacsLukacs在在19811981年首先提出年首先提出，他们使，他们使用了用了75mm75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。19841984年年TerabeTerabe将胶束引入毛细管电泳将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管，开创了毛细管电

34、泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（色谱（MEKCMEKC）。）。19871987年年HjertenHjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，。同年，CohenCohen发表了毛细发表了毛细管凝胶电泳的工作。管凝胶电泳的工作。近年将液相色谱固定相引入毛细管电泳中，又发展了近年将液相色谱固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱电色谱，扩大了电泳的应用范围。，扩大了电泳的应用范围。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器电泳仪的使用方法电泳仪的使用方法1.将电泳槽两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。将电泳槽两个

35、电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定终止接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定终止时间，此时电泳即开始进行。时间，此时电泳即开始进行。3.完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。例如：例如：聚丙烯酰胺凝胶电泳操作聚丙烯酰胺凝胶电泳操作 制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶电泳操作视频琼脂糖凝胶电泳操作视频分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器 电泳常见问题及对策电泳常见问题及对策分子生物学实验常用方法与仪

36、器分子生物学实验常用方法与仪器电泳仪使用注意事项电泳仪使用注意事项如果输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。注意保持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。本仪器输出电压较高，使用中应避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。长期不用仪器，应放置在干燥通风的清洁环境中保存。特别注意：特别注意：溴化乙锭（溴化乙锭（EB）：）：为致癌剂，为致癌剂，414实验室的所有电泳系统不得使用实验室的所有电泳系统不得使用EB。包括制胶和跑包括制胶和跑胶过程都不得加入胶过程都不得加入EB。用含。用含EB

37、的溶液进行浸泡时应戴手套，浸泡后转移至拍照过程中的溶液进行浸泡时应戴手套，浸泡后转移至拍照过程中应放在容器内或者保鲜膜上，严禁在转移过程中出现滴水现象，尽量减少地面与台面污应放在容器内或者保鲜膜上，严禁在转移过程中出现滴水现象，尽量减少地面与台面污染。染。建议使用荧光染料建议使用荧光染料。琼脂糖胶严禁倒入水池，以免产生堵塞。琼脂糖胶严禁倒入水池，以免产生堵塞。准备转化态细胞42热冲击电转化加入外源DNA细胞复苏平板筛选CaCl210%甘油蓝白斑筛选+ 抗生素 + IPTG + X-gal 要灵活运用，根据不同情况设计筛选策略！2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖分子生

38、物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.3聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 2.3.1 PCR技术简介技术简介 2.3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.3.1 PCR技术简介技术简介何谓PCR？ 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 PCR原理 PCR的要素 基本的PCR须具备：1

39、.要被复制的DNA模板 (Template) 2.界定复制范围两端的引物(Primers). 3.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。 PCR的反应包括三个主要步骤 1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 Denaturing是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. Annealing则是令Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最 后 在 D N A 聚 合 酶 ( e . g . T a q p o l y

40、m e r a s e ) 的 作 用 下 进 行 引 物 的 延长 (Extension of primers)及另一股的合成。 分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况第一代：手动第一代：手动/ /机械手式水浴基因扩增仪机械手式水浴基因扩增仪用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94）低温复性温度（如58），适温延伸温度（如72）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工/机械在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的

41、热循环： 94 30S 58 45S 72 60S 40次循环优点：温度变化快，时间准确优点：温度变化快，时间准确缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐早期机型早期机型分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器 2.3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况 第二代：自动化控制型定性基因扩增仪第二代：自动化控制型定性基因扩增仪 与上述水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。 （1 1）变温金属块作恒温装置）变温金属块作恒温装置 加热方式有电热发热、半导体发热，制冷方式有半导

42、体制冷和压缩机制冷等多种方式。 特点是产品质量和性能较稳定，最常见的方式。（2 2）空气驱动循环恒温装置）空气驱动循环恒温装置 本系统力求降低部件的成本，用空气作为热传导媒介。装置包括机箱（外壳）、热源、冷空气源、控制器和辅助电器元件等部分。 优点：不用金属的精密加工，成本降低。整个系统没有液体流动，不用致冷液，因而安全程度高。 缺点：单纯靠外部空气制冷，受环境温度影响。分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况 第三代：终点定量第三代：终点定量/ /半定量半定量 第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度

43、及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能： 潜伏期病毒浓度探测 感染程度 致病病原体数量变化测定 抗病毒药物疗效评估 恢复期病毒载量检测终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品，而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少，国产仪器较多西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等 分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况第四代：实时定量第四代：实时定量PCRPCR仪仪自动分析软件自动分析软件实时荧光定量试剂实时荧光定量试剂实时定量实时定量PCRPCR仪仪通用电脑通用电脑PCR-DNA/RNA实

44、时荧光定量检测系统实时荧光定量检测系统分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况传统的传统的4848孔孔/96/96孔板式定量孔板式定量PCRPCR仪仪 创新概念的离心式实时定量创新概念的离心式实时定量PCRPCR仪仪 Rotor-Gene 6000 定量PCR仪3D演示分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.3.2 热循环仪的原理及发展状况热循环仪的原理及发展状况Smart CyclerII获得过1998年美国研发R&D100金奖。Smart CyclerII的机型小巧，只有16个样品槽，它的独到之

45、处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量PCR仪！第三类的荧光定量第三类的荧光定量PCRPCR仪以仪以CepheidCepheid公司的公司的Smart CyclerIISmart CyclerII为代表为代表分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器2.4 实时定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物

46、学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器3. 凝胶成像检测凝胶成像检测 3.1 常见凝胶成像设备常见凝胶成像设备 3.2 凝胶成像系统操作程序凝胶成像系统操作程序分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器3.1 常见凝胶成像设备常见凝胶成像设备Gene genius Gene genius 凝胶成像系统凝胶成像系统分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器3.1 常见凝胶成像设备常见凝胶成像设备ChemiDoc XRS

47、ChemiDoc XRS 化学发光凝胶成像系统化学发光凝胶成像系统分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器ChemiDoc XRS ChemiDoc XRS 化学发光凝胶成像系统化学发光凝胶成像系统ChemiDoc XRS化学发光成像系统是当前该系列中最先进的化学发光检测系统：可进行Chemiluminescence (Chemiluminescence (化学发光检测），化学发光检测），Fluorescence Fluorescence （荧光检测），（荧光检测），Colorimetric Colorimetric detection (detection (光密度成像光密度

48、成像) )，Gel documentation (Gel documentation (凝胶成像凝胶成像) )。有以下应用：Nucleic Acid DetectionWestern Blotting1D and 2-D Protein GelsEthidum bromideImmun-Star HRP & APSYPRO rubySYBR greenECLSYPRO redSYBR goldECL plusSYPRO orangeTexas red （德克萨斯红）Copper StainRhodamine（罗丹明）Silver StainCoumarin （香豆素，荧光染料）Zinc sta

49、inHoechst （细胞核染色或DNA染色）CoomassieDensitometryColony countingCarbohydrate AnalysisNegativeBetagalactocidaseANTsX-ray filmGFP分子生物学实验常用方法与仪器分子生物学实验常用方法与仪器 ChemiDoc XRS ChemiDoc XRS 化学发光凝胶成像系统化学发光凝胶成像系统Ethidum Bromide: Precision Molecular Mass Ruler, agarose gelSYBR Green: Precision Molecular Mass Ruler,

50、 agarose gelRhodamine B: Solution in a microtiter plate.SYPRO ruby: Broad Range Standards, Acrylamide gelCy3: End-labeled 23mer oligo, acrylamide gelImmun-Star: Dot blot of a serial dilution of Transferrin proteinHoeschst: Precision Molecular Mass Ruler, acralymide gelApplication SensitivityChemiDoc