分子生物学第五章-分子生物学研究法课件.ppt

1、第五章第五章 分子生物学研究方法分子生物学研究方法1 1、重组、重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件2 2、DNADNA操作技术操作技术3 3、RNARNA基本操作技术基本操作技术4 4、核苷酸序列分析、核苷酸序列分析n分子生物学分子生物学从从2020世纪中叶开始高速发世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因工程技术的进步。n基因操作：基因操作：DNADNA的切割和连接、核酸的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点酸序列分析、基因的

2、人工合成、定点突变和突变和PCRPCR扩增。这是分子生物学研扩增。这是分子生物学研究的究的核心技术核心技术。n基因工程：基因工程：在体外将核酸分子插入载在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。行持续稳定的繁殖和表达。n跨越天然物种屏障、把来自任何生跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于物的基因置于毫无亲缘关系毫无亲缘关系的新的的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特工程技术区别于其他技术的根本特征。征。n本章将在回顾重组本章将在回顾重组DNADNA技术史上主技术史上

3、主要事件基础上，讨论要事件基础上，讨论DNADNA操作技术、操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等的分离与鉴定等3 3个环节个环节。51 51 重组重组DNADNA技术史上的重大事技术史上的重大事件件n半个世纪以来，分子生物学研究主要取半个世纪以来，分子生物学研究主要取得了得了3 3大成就大成就: : 第一第一 解决了解决了遗传的物质基础问题遗传的物质基础问题 基因的分子载体是基因的分子载体是DNA; DNA; 51 51 重组重组DNADNA技术史上的重大事技术史上的重大事件件 第二第二 DNADNA分子的双螺旋结构模型和半保分子的双螺旋结构模型

4、和半保 留复制机制，解决了留复制机制，解决了基因的自我基因的自我 复制和世代交替问题复制和世代交替问题; ; 51 51 重组重组DNADNA技术史上的重大事技术史上的重大事件件 第三第三 “ “中心法则中心法则”和操纵子学说，和操纵子学说，成成 功地破译了遗传密码，阐明了功地破译了遗传密码，阐明了 遗传信息的流动与表达机制。遗传信息的流动与表达机制。nDNADNA分子体外分子体外切割与连接切割与连接技术及核苷酸技术及核苷酸序序列分析技术列分析技术的进步直接推动了重组的进步直接推动了重组DNADNA技技术的产生和发展。术的产生和发展。n重组重组DNADNA的核心是用的核心是用限制性核酸内切酶限

5、制性核酸内切酶和和DNADNA连接酶连接酶对对DNADNA分子进行体外切割和连接。分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。史上最重要的事件。n限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开切开DNADNA。19721972，BoyerBoyer实验室发现核酸内实验室发现核酸内切酶切酶EcoR IEcoR I能特异识别能特异识别GAAUCGAAUC序列，将序列，将DNADNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。段。nEcoR lEcoR l酶切产生的任何

6、不同来源的酶切产生的任何不同来源的DNADNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此而彼此“粘合粘合”起来。起来。n目前为止，科学家已经几乎能随心所目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不连分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。供下一步研究。52 DNA52 DNA基本操作技术基本操作技术 521 521 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术1. 1. 基本原理基本原理 生物大分子在一定生物大分子在

7、一定pHpH条件下，通常会条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。的速度移向适当的电极。521 521 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳1. 1. 基本原理基本原理 分子在电场作用下的迁移速度与分子在电场作用下的迁移速度与电电场强度场强度和电泳分子所带的净电荷数成和电泳分子所带的净电荷数成正正比比，与分子的摩擦系数成与分子的摩擦系数成反比反比。摩擦系。摩擦系数是数是分子大小分子大小、极性及介质粘度的函数。、极性及介质粘度的函数。521 521 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳1. 1. 基本原理基本原理 根据分子大小、构型或形状的差异

8、和根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。分子混合物中的各种成分彼此分离。nDNADNA和和RNARNA多核苷酸链称为多聚阴离子多核苷酸链称为多聚阴离子( (磷磷酸基团酸基团) )，在电场中会向正电极的方向迁，在电场中会向正电极的方向迁移。移。n在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移速分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的度，取决于核酸分子本身的大小和构型大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离这就是应用凝胶电泳技术分离DNADNA片段的片段的基本原理。基本原理。2. 2. 琼脂

9、糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n化学修饰的低熔点琼脂糖化学修饰的低熔点琼脂糖( (线性多糖聚合线性多糖聚合物物) )，在较低温度下便会熔化，冷却凝固，在较低温度下便会熔化，冷却凝固便形成良好的电泳介质。常用于便形成良好的电泳介质。常用于DNADNA片段片段的电泳制备。的电泳制备。n琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2-0.2-50kb50kb之间之间; ;而聚丙烯酰胺凝胶而聚丙烯酰胺凝胶(SDS)(SDS)分辨分辨范围为范围为1-1000bp1-1000bp之间。之间。n凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分

10、辨能力小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。就越强。n如如20%20%的的SDSSDS凝胶可分离凝胶可分离1-6bp1-6bp的的DNADNA小片小片段，而分离段，而分离1000bp1000bp的的DNADNA片段则用片段则用3%3%的的SDSSDS凝胶。凝胶。n再如再如2%2%琼脂糖凝胶可分离琼脂糖凝胶可分离300bp300bp的双链的双链DNADNA分子，而分离分子，而分离大片段大片段DNADNA就要用低浓就要用低浓度度( (0.3%-1.0%)0.3%-1.0%)的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。n脉冲电场凝胶电泳（脉冲电场凝胶电泳（PFGE)PFGE)可分离可分离50Kb50Kb的的DN

11、ADNA小片段小片段n溴化乙锭溴化乙锭(EB)(EB)能插入到能插入到DNADNA或或RNARNA分子的分子的相相邻碱基之间邻碱基之间( (图图5-4)5-4)，并在，并在300nm300nm波长的紫波长的紫外光照射下发出荧光外光照射下发出荧光, , 荧光强度与荧光强度与DNADNA片段片段的数量成正比的数量成正比( (可检测到可检测到0.05g0.05g的的DNA) DNA) 。n把把EBEB直接加到凝胶介质中或电泳后染色。直接加到凝胶介质中或电泳后染色。n细菌转化：细菌菌株由于捕获了外源细菌转化：细菌菌株由于捕获了外源DNADNA导导致性状特征发生遗传改变的生命过程。致性状特征发生遗传改变

12、的生命过程。n大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。也是基因工程重要的实验菌株。5.2.2 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNADNA分子的增殖分子的增殖5.2.2 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNADNA分子的增殖分子的增殖n供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克隆隆n细菌转化方法细菌转化方法 CaCl2CaCl2法、电击法（电脉冲）、体外包装法法、电击法（电脉冲）、体外包装法（噬菌体）（噬菌体）n大肠杆菌低温大肠杆菌低温(0)(0)预处理的低渗氯化钙预处理的低渗氯化

13、钙溶液中，外源溶液中，外源DNADNA粘附在细胞表面，立即粘附在细胞表面，立即将其转到将其转到4242下做短暂的热刺激，外源下做短暂的热刺激，外源DNADNA被细胞所吸收（感受态）。被细胞所吸收（感受态）。5.2.2 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNADNA分子的增殖分子的增殖523 523 基因扩基因扩增增n 聚合酶链式反应聚合酶链式反应即即PCRPCR技术，是一种在体外快速扩增技术，是一种在体外快速扩增特定基因或特定基因或DNADNA序列的方法。它可以在序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定将极微量的

14、目的基因或某一特定DNADNA片片段扩增数十万乃至千百万倍。段扩增数十万乃至千百万倍。PCRPCR技术的原理技术的原理n先将双链先将双链DNADNA分子加热分离成单链，单分子加热分离成单链，单链链DNADNA模板种模板种dNTP DNAdNTP DNA聚合酶聚合酶新生的新生的DNADNA互补链。互补链。n新合成的新合成的DNADNA链的起点，由加入到反应链的起点，由加入到反应体系中的一对引物决定的。体系中的一对引物决定的。PCRPCR反应的全过程反应的全过程n反应包括反应包括DNADNA解链解链( (变性变性) )、引物与模、引物与模板板DNADNA相结合相结合( (退火退火) )、DNADN

15、A合成合成( (延伸延伸) )三步，三步，被不断重复。被不断重复。n多次循环之后，反应混合物中所含有的双多次循环之后，反应混合物中所含有的双链链DNADNA数，即两条引物位点之间的数，即两条引物位点之间的DNADNA区段区段的拷贝数，的拷贝数，理论上的最高值是理论上的最高值是2 2n n。n待扩增待扩增DNADNA样品样品94 1min 94 1min 变性变性( (解链解链) ) 56 1min 56 1min 退火退火( (引物结合靶引物结合靶DNADNA区段区段) ) 72 172 1至数分钟至数分钟延伸，合成新生延伸，合成新生DNADNA互补链。互补链。n以上循环在同一个以上循环在同一

16、个PCRPCR管中进行。反应物加完管中进行。反应物加完后，温度由后，温度由PCRPCR仪调整，程序完成后可以拿到仪调整，程序完成后可以拿到产物。产物。n聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) PCR是是80年代中期发展起来的体外核年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。酸扩增技术。 PCR技术是生物医学领域中技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。的一项革命性创举和里程碑。n【开发史】【开发史】这项技术的发明人是这项技术的发明人是Kary Mullis。1983年，在一家生物高技术公司（年，在一家生物高技术公司（Cetus）工作）工作的的Mullis着

17、手解决用简单的方法鉴定某一段着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州加州101号高速公路上，灵机一动想到了一号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，的简单方法，即即PCR。 在在1985年的一次学术会议上，此方法年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了了链链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。么做。 Ce

18、tus给了给了Mullis一万美元一万美元的奖金，随后的奖金，随后把这项技术的专利以把这项技术的专利以三亿美元三亿美元的价格转让给另的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，一家生物高技术公司。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年分子生物学领域最重要的一项技术突破。分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，年，Mullis因此获得因此获得诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。 (1)PCR(1)PCR技术简史技术简史n核酸研究已有核酸研究已有100

19、多年的历史，本世纪多年的历史，本世纪60年年代末、代末、70年代初人们致力于研究基因的体年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，外分离技术，Korana于于1971年最早提出核年最早提出核酸体外扩增的设想：酸体外扩增的设想：“经过经过DNA变性，与变性，与合适的引物杂交，用合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆并不断重复该过程便可克隆tRNA基因基因”。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解旋酶解链酶解链酶DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长A

20、TCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶引物酶引物酶RNARNA引物引物RNARNA引物引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶

21、聚合酶DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53GGAUCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35AUCGCG5ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNADNA的变性与复性的变性与复性变性复性加热加热退火退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA的变性与复性的变性与复性变性复性加热加热退火退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGC

22、GCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA的变性与复性的变性与复性变性复性加热加热退火退火PCR的实现的实现n耐热耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能能高效率的进行，随后高效率的进行，随后PE-Cetus公司公司推出了第一台推出了第一台PCR自动化热循环仪自动化热循环仪n1993年，年，Mullis等因此项技术获诺贝等因此项技术获诺贝尔化学奖尔化学奖 1985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于似于DNA的体内复制，只是

23、在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合的体外合成提供以致一种合适的条件成提供以致一种合适的条件-摸板摸板DNA ，寡核苷酸引，寡核苷酸引物，物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性变性、复性及延伸的温度与时间。及延伸的温度与时间。nMullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚聚合酶合酶 I 的的Klenow片段，其缺点是：片段，其缺点是：Klenow酶不酶不耐高温，耐高温， 90失活，每次循环都要重新加。失活，每次循环都要重新加。引引物链延伸反应在物链延伸反应在37下进行易发生碱基错配，其下进行易发生碱基错配，

24、其PCR产物特异性较差，合成的产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。片段不均一。PCR的改进与完善的改进与完善n1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，其扩增的，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一片段。但每循环一次，仍需加入新酶。次，仍需加入新酶。PCR的改进与完善的改进与完善n1988年，年，Saiki 等从温泉中分离的一株等从温泉中分离的一株水生水生嗜热杆菌嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一中提取到一种种耐热耐热DNA聚合酶。聚合酶。

25、n具有以下特点：具有以下特点：耐高温耐高温。热变性不被热变性不被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高扩增片段特异性和扩增效率，大大提高扩增片段特异性和扩增效率，增加扩增长度增加扩增长度(2.0Kb)。n此酶命名为此酶命名为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。具有较高的特异性、灵。具有较高的特异性、灵敏性和效率，此酶的发现使敏性和效率，此酶的发现使PCR广泛广泛的被应用。的被应用。nPCR即在体外模拟即在体外模拟DNA复制的过程，加热复制的过程，加热变性使变性使DNA变成单链，人工合成变成单链，人工合成2个引物个引物让它

26、们结合到让它们结合到DNA模板的两端，模板的两端， DNA聚合聚合酶即可以大量复制该模板。酶即可以大量复制该模板。（2）PCR技术的基本原理技术的基本原理 n假定我们要研究的假定我们要研究的DNA双链两端的序列是双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAnPCR前先人工合成两段有前先人工合成两段有20-30碱基的碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配引物，能够分别与上下两条链的一端配对，把这两段引物和对，把这两段引物和DN

27、A模板、模板、 DNA聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做一起，我们就可以开始做PCR了。了。n第一步第一步模板模板DNA的变性的变性：模板模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；作准备；第二步模板第二步模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板模板DNA经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板左右

28、，引物与模板DNA单链的互补序列单链的互补序列配对结合；配对结合；n第三步引物的延伸第三步引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，以用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性链互补的半保留复制链重复循环变性-退火退火-延伸三过程，就可获得更多的延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需每完

29、成一个循环需24分钟，分钟， 23小时小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应反应（3 3）PCRPCR的反应体系与反应条件的反应体系与反应条件PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应五要素反应五要素：引物、酶、引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+引物：引物： PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板板DNA序列，序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用链做引物，利用PCR就可将模板就可将模板DNA在

30、体外在体外大量扩增。大量扩增。循环次数循环次数:循环次数决定了循环次数决定了PCR的扩增程度。的扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板循环次数主要取决于模板DNA的浓度。的浓度。一般的循环次数选在一般的循环次数选在3040次之间，循次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。增多。设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物长度引物长度: 15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。引物扩增跨度：以引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩为宜，特定条件下可扩增长至增长至10kb的片段。的片段。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含

31、量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增太少扩增效果不佳，效果不佳，G+C过多易出现非特异条带过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。聚体，产生非特异的扩增条带。引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配基，应严格要求配对，以避免因末端

32、碱基不配对而导致对而导致PCR失败。失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析这对酶切分析或分子克隆很有好处。或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。它序列无明显同源性。n酶及其浓度酶及其浓度目前有种目前有种Taq DNA聚合酶，聚合酶， 催化一催化一典型的典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应体指总反应体积为积为100u时时)，浓度过高可引起非特异性，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度

33、过低则合成产物量减少。扩增，浓度过低则合成产物量减少。ndNTP的质量与浓度的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密扩增效率有密切关系，切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以后，以1M NaOH或或1M TrisHCl的缓冲液将的缓冲液将其其pH调节到调节到7.07.5，小量分装，小量分装，-20冰冻冰冻保存。多次冻融会使保存。多次冻融会使dNTP降解。降解。n在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50-200umol/L

34、，尤其是注意尤其是注意4种种dNTP的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔等摩尔配制配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几，如其中任何一种浓度不同于其它几种时种时(偏高或偏低偏高或偏低)，就会引起，就会引起错配错配。浓度过。浓度过低又会降低低又会降低PCR产物的产量。产物的产量。dNTP能与能与Mg2 +结合，使游离的结合，使游离的Mg2 +浓度降低。浓度降低。n模板模板(靶基因靶基因)核酸核酸模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成成败与否的关键环节之一，传统的败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化纯化方法通常采用方法通常采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K来消化处理来消化处理标本。标

35、本。SDS主要功能是：主要功能是： 溶解细胞膜上的脂溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶蛋白酶K能水解蛋白质，特别是组蛋能水解蛋白质，特别是组蛋白，再用有机酚与氯仿抽提掉蛋白质和其白，再用有机酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。RNA模板提取一般采用模板提取一般采用异硫氰酸胍或异硫氰酸胍或蛋白酶蛋白酶K法法，要防止要防止RNase降解降解RNA。nMg2+浓度浓度Mg2

36、+对对PCR扩增的特异性和产量扩增的特异性和产量有显著的影响，有显著的影响，PCR反应中各反应中各dNTP浓浓度为度为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。为宜。 nMg2+浓度浓度Mg2+浓度过高，反应特异性降低，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。聚合酶的活性，使反应产物减少。PCRPCR的基本原理的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间（时间（minmin）温度温度（）适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1

37、1低温退火低温退火2 2重复重复1 1 3 3步步2525 3030轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板模板DNADNA9595PCR的基本原理nPCR反应条

38、件nPCR过程nPCR的特点955050引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物7272TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第第1 1轮结束轮结束9595第第2 2轮开始轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点95507272TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点7272第2轮结束nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复30轮后230=1,073,

39、741,824模板DNA第第1 1轮扩增轮扩增第第2 2轮扩增轮扩增第第3 3轮扩增轮扩增第第4 4轮扩增轮扩增 第第5 5轮扩增轮扩增第第6 6轮扩增轮扩增理想拷贝数理想拷贝数=2=2n n n n 循环次数循环次数实际拷贝数实际拷贝数=(1+x)=(1+x)n n X X 平均效率平均效率, ,约为约为0.850.85 n n 循环次数循环次数 电泳分析电泳分析PCR设备设备电泳分析（4）PCR反应特点反应特点 特异性强：特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：反应的特异性决定因素为： 引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合；特异正确的结合； 碱基配对原则；碱基配对原则； Taq DNA

40、聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和

41、保守性高很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克将皮克(pg=-10-12)量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达的灵敏度可达3个个RFU(空空斑形成单位斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为；在细菌学中最小检出率为3个细菌。个细菌。简便、快速：简便、快速：PCR反应用耐高温的

42、反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅扩增液和水浴锅上进行变性上进行变性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24 小时完小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低：对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗粗制品及总制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、

43、细胞、活标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的组织等粗制的DNA扩增检测。扩增检测。（5 5）PCRPCR的应用的应用n在分子生物学基础研究上，被广泛地用于基因克隆和在分子生物学基础研究上，被广泛地用于基因克隆和制造突变。制造突变。 n研究研究n基因克隆，基因克隆，DNADNA测序，分析突变测序，分析突变n诊断诊断n细菌、病毒、寄生虫检测，诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断n人类基因组工程人类基因组工程n遗传图谱的构建，遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱测序，表达图谱n法医法医n犯罪现场标本分析犯罪现场标本分析n肿瘤肿瘤n各种肿瘤检测各种肿瘤检测n其他其他n在临床医学上，在临床

44、医学上，PCR被用于鉴别遗传疾病被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而现在用体培养数周才能鉴定，而现在用PCR，即，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是否存在病毒、病菌的中是否存在病毒、病菌的DNA（比如（比如HIV的的DNA）而确诊。）而确诊。在法医上，在法医上，PCR目前已成为发现罪证目前已成为发现罪证的重要方法。比如，的重要方法。比如，0.1微升的唾液痕迹所微升的唾液痕迹所含的含的DNA就可以通过就可以

45、通过PCR扩增而获得足够扩增而获得足够量的量的DNA进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。 利用利用PCR技术，科学家们已从林肯的头技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的中提取了足够的DNA进行研究。博物馆中进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一门分子古生物学因此诞生。象，一门分子古生物学因此诞生。5

46、.2.4 实时定量实时定量PCR 1. SYBR Green I探针探针(1种荧光）种荧光） 2. Taq Man探针探针(2种荧光，短波长和长波长）种荧光，短波长和长波长）5.2.4 实时定量实时定量PCR 1. 随着新合成目的随着新合成目的DNA片段的增加，结合到片段的增加，结合到 DNA上的荧光探针被激发的荧光相应增加。上的荧光探针被激发的荧光相应增加。 2. Taq Man探针三要素：探针三要素： 短波长荧光基团短波长荧光基团 目的目的DNA特异的碱基序列特异的碱基序列 长波长荧光基团长波长荧光基团5.3 RNA基本操作技术基本操作技术（1）高质量）高质量mRNA的制备的制备应用应用P

47、romega PolyAT tract mRNA Isolation System分离分离Poly(A)RNA。将。将(dT)引物与细胞总引物与细胞总RNA共温育，加入与共温育，加入与微磁球相连的吸附物，用磁场吸附与微磁球相连的吸附物，用磁场吸附与PMP相连的相连的Oligo(dT)-mRNA。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术（2）反转录成）反转录成cDNAn可同时在反转录系统中加入可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物及随机引物R6，以保证得到，以保证得到全长全长cDNA；应选用活性较高的反转录；应选用活性较高的反转录酶。酶。n应选用甲基化应选用甲基化d

48、CTP；应保证所获得双；应保证所获得双链链cDNA的方向性。的方向性。54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析n仪器分析发展很快。仪器分析发展很快。n如果将来做测序工作，有了分子生物如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。学基础，就可以做。n如果将来工作中需要测序，一般送到如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。公司去测。n下面介绍测序的基本原理。下面介绍测序的基本原理。54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析nSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法利用聚合酶能够利用双脱利用聚合酶能够利用双脱氧核苷三磷酸作底物掺入到核苷酸链氧核苷三磷酸作底物掺入到核苷酸链中而终止链的生长（双脱氧

49、核中而终止链的生长（双脱氧核苷三磷酸没有苷三磷酸没有基团）。基团）。54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析nMaxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法硫酸二甲酯、肼、六氢吡啶硫酸二甲酯、肼、六氢吡啶放放射标记片段射标记片段碱基特异性切割碱基特异性切割不同长度片段不同长度片段凝胶电泳和凝胶电泳和放射自显影放射自显影读出序列。读出序列。54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析n序列分析自动化序列分析自动化四甲基若丹明作荧光剂。四甲基若丹明作荧光剂。激光激光计算机自动分析计算机自动分析54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析n杂交测序法（）杂交测序法（）寡寡核苷酸探针核苷酸探针靶靶完全完全双链杂交分子双链杂交分子比较分析比较分析推断靶推断靶序列序列54 54 核苷酸序列分析核苷酸序列分析n杂交测序法（）杂交测序法（）