利用PCR反应进行人类性别鉴定课件.ppt

1、实验八实验八 PCRPCR反应鉴定人类性别反应鉴定人类性别 一、一、 实验目的实验目的了解有关了解有关PCR反应的原理及技术反应的原理及技术 要点。要点。学习应用学习应用PCR反应进行性别鉴定的反应进行性别鉴定的原理及方法。原理及方法。二、二、PCRPCR反应的原理反应的原理 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，简称简称PCRPCR）是一种在体外特异扩增位于两段已知）是一种在体外特异扩增位于两段已知序列之间序列之间DNADNA区段的核酸合成技术，是分子生物区段的核酸合成技术，是分子生物学研究领域的一项

2、创举。该技术是由美国学研究领域的一项创举。该技术是由美国CetusCetus公公司和加利福利亚大学司和加利福利亚大学19851985年联合发明的，主要贡年联合发明的，主要贡献者为献者为MullisMullis和和HeneryHenery、ErlichErlich。 利用利用PCRPCR可将极微量的靶可将极微量的靶DNADNA特异地扩增上百特异地扩增上百万倍，从而大大提高对万倍，从而大大提高对DNADNA分子的分析和检测能分子的分析和检测能力。由于力。由于PCRPCR具有敏感性高、特异性强、快速、具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，因此在分子生物学、微生物学、医简便等优点，因此在分子生物学

3、、微生物学、医学及遗传学、法医判定和考古研究等领域得到广学及遗传学、法医判定和考古研究等领域得到广泛应用。泛应用。 PCRPCR主要由反复循环的主要由反复循环的变性变性、退火退火和和延伸延伸三个步三个步骤构成：即在高温（骤构成：即在高温（9595）下，使靶）下，使靶DNADNA双链受双链受热变性成为两条单链；而后在低温（热变性成为两条单链；而后在低温（37375555）下，两条寡核苷酸引物与互补的单链下，两条寡核苷酸引物与互补的单链DNADNA模板结模板结合，形成部分双链；在合，形成部分双链；在TaqTaq酶的最适温度（酶的最适温度（7272）下，以引物下，以引物33端为合成的起点，以单核苷酸

4、为端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以原料，沿模板以5353方向延伸，合成方向延伸，合成DNADNA新新链。这样，经过一次循环目的链。这样，经过一次循环目的DNADNA产物增加产物增加1 1倍。倍。如此反复进行，如此反复进行，PCRPCR产物得以产物得以2 2n n的指数形式迅速的指数形式迅速扩增。扩增。PCRPCR基本原理示意图基本原理示意图PCRPCR反应体系的组成反应体系的组成模板模板 PCRPCR可以可以DNADNA或或RNARNA为模板进行核酸的体外为模板进行核酸的体外扩增。不过扩增。不过RNARNA的扩增首先需逆转录成的扩增首先需逆转录成cDNAcDNA后才能进行后才能进行P

5、CRPCR循环。模板循环。模板DNADNA浓度对扩增有浓度对扩增有一定影响。一定影响。引物引物 PCRPCR反应的特异性取决于引物的特异性，扩反应的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由引物限定的。增产物的大小也是由引物限定的。 引物长度至少应含有引物长度至少应含有1616个核苷酸，最好长达个核苷酸，最好长达20-2420-24个核苷酸。这种长度的引物在聚合反应温个核苷酸。这种长度的引物在聚合反应温度下不会形成稳定二聚体。度下不会形成稳定二聚体。 PCRPCR反应中引物的终浓度通常为反应中引物的终浓度通常为1mol/L.1mol/L.当当PCRPCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴

6、性。引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。引物二聚体的形成。缓冲液缓冲液 提供提供Taq DNATaq DNA聚合酶最适酶促反应条件。聚合酶最适酶促反应条件。常用的缓冲体系为常用的缓冲体系为50 Mm KCl50 Mm KCl，10 mM Tris-10 mM Tris-HCl (pH8.3,RT) HCl (pH8.3,RT) 。 另外还需要一定浓度的另外还需要一定浓度的Mg2+Mg2+，一般浓度为，一般浓度为1.5mM1.5mM。这是。这是Taq DNATaq DNA聚合酶活性所必需。另

7、外聚合酶活性所必需。另外它还影响着引物的退火、模板与它还影响着引物的退火、模板与PCRPCR产物的解产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。Mg2+Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。通常会导致非特异性扩增产物的累积。 脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP） 作为作为DNADNA合成的基本原料。合成的基本原料。dNTPdNTP含量太含量太低，低，PCRPCR扩增产量太少、易出现假阴性。过扩增产量太少、易出现假阴性。过高的高的dNTPdNTP浓度会导致聚合

8、时的错误掺入，浓度会导致聚合时的错误掺入，因此应当避免。一般在因此应当避免。一般在200mol/L200mol/L浓度下浓度下使用。使用。耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 目前有两种目前有两种Taq DNATaq DNA聚合酶供应：从噬热聚合酶供应：从噬热水生菌水生菌Thermus AquaticusThermus Aquaticus（TaqTaq）中分离提纯）中分离提纯的天然酶和大肠杆菌合成的基因工程酶。在的天然酶和大肠杆菌合成的基因工程酶。在PCRPCR反应中，每反应中，每100l100l反应液中含反应液中含1-2.5U Taq 1-2.5U Taq DNADNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会

9、使扩增产物聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。性扩增。温度循环参数温度循环参数 变性温度与时间变性温度与时间 通常选用通常选用95 30s95 30s。复性温度与时间复性温度与时间 复性温度决定着复性温度决定着PCRPCR的特异性。温度越低复性越好，的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为5555左右。左右。延伸温度与时间延伸温度与时间 一般为一般为7272。这个温度即考虑了。这个温度即考虑了Taq DNATaq DNA聚合酶的聚合

10、酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合活性，又考虑到引物和靶基因的结合。循环数循环数 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。 三、利用三、利用PCRPCR反应进行性别鉴定反应进行性别鉴定 原理原理 DYZ1位于位于Y染色体长臂的染色体长臂的号卫星号卫星区域内，具有区域内，具有3.4kb的重复序列，拷贝数的重复序列，拷贝数约约5000，其特异序列的，其特异序列的PCR扩增可用于扩增可用于性别鉴定。扩增产物为性别鉴定。扩增产物为154bp.四、实验材料四、实验材料DNA释放液：

11、含有蛋白酶释放液：含有蛋白酶KPCR反应液：含有特异引物、反应液：含有特异引物、dNTP混合混合 液和缓冲液。液和缓冲液。Taq酶酶液体石蜡液体石蜡无菌水无菌水五、实验步骤五、实验步骤（一）、模板的制备（一）、模板的制备 1 .冷开水漱口后，用牙签刮取口腔黏膜细冷开水漱口后，用牙签刮取口腔黏膜细 胞。取胞。取80ul DNA释放液，牙签插入后，释放液，牙签插入后， 涡旋片刻。涡旋片刻。2. 50水浴水浴20分钟。分钟。3. 弃牙签，石蜡油覆盖后离心片刻。弃牙签，石蜡油覆盖后离心片刻。94 处理处理10分钟。分钟。（二）、加样及（二）、加样及PCRPCR扩增扩增1.PCR反应体系反应体系：总体积：总体积20 ulPCR反应液反应液 15 ulDNA模板模板 5ul2.设置对照：设置对照：空白对照空白对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照（三）、扩增参数（三）、扩增参数预变性：预变性：94 5min变性：变性：94 30s, 退火：退火：55 30s, 重复重复35 cycles聚合：聚合：72 60s72 5min（四）、电泳与结果判断（四）、电泳与结果判断