(公开课)分解尿素的细菌、分解纤维素的微生物的分离说课讲解课件.ppt

1、允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组 对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种 目的目的 结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是找规律：找规律：1：判断某个培养基是否具有选择作用时，：判断某个培养基是否具有选择作用时，应设立应设立_培养基进行对照。培养基进行对照。2

2、：判断所使用的培养基是否被杂菌污染：判断所使用的培养基是否被杂菌污染时，应设立时，应设立_培养基进行空培养基进行空白对照？白对照？基基 础础不接该菌种的不接该菌种的在设计实验时，一定在设计实验时，一定要涂布至少要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性与准确性。在分析实验结果时，。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验重新实验。计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数 =（CV）M某同学

3、在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基判断培养基的制备是否合格（有无被杂菌污染）的制备是否合格（有无被杂菌污染）：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是主要目的是排除排除实验组中实验组中非测试因素非测试因素对实验

4、对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去先铲去表层土表层土3 cm3 cm左右左右，再取样，将样品装入事先准备好的，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。用前都要灭菌。实验时要对培养皿作好标记。注明实验时要对培养皿作好标记。注明培养培养基类型基类型、培养时间培养时间、稀释度稀释度。还少了什么吗？还少了什么吗？未接种的选择培养基未接种的选择培养基接种的完全培养基接种的完全培养基1 1、

5、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培养基种类、培养日期、稀释度等。注明培养基种类、培养日期、稀释度等。 三、三、纤维素是地球上含量最丰富纤维素是地球上含量最丰富的的多糖类多糖类物质，植物每年产物质，植物每年产生的纤维素超过生的纤维素超过7070亿吨；分亿吨；分布植物的根、茎、叶中；布

6、植物的根、茎、叶中；纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源一、基础知识一、基础知识纤维素酶纤维素酶纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素一、基础知识一、基础知识 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生

7、有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。能力。3 3、纤维素的分解、纤维素的分解请用一个简单的实验来验证此问题请用一个简单的实验来验证此问题纤维素酶水解滤纸实验纤维素酶水解滤纸实验1U表示表示1个酶活力单位，是指在温度为个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，如，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在等，均为最适的情况下，在1min内转化内转化1mmol的底物所需的的底物所需的酶量。酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶所作用和催化的化合物。 试管AB

8、滤纸条1cmx6cm1cmx6cm缓冲液10ml11ml纤维素酶1ml/振动1h1h现象分解不分解纤维素酶的作用对照实验（2 2）纤维素分解菌的筛选）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，但不能和水解后的纤维二糖和葡萄但不能和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应糖发生这种反应。当纤维素被当纤维素被_分解后，分解后，红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，可以通过，可

9、以通过_ 来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈实验原理实验原理 即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤

10、维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯

11、度稀释稀释将样品涂将样品涂布到布到鉴别鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样?培养的目的培养的目的? ? 挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法对比课题对比课题3 3与课题与课题2 2实验流程，实验流程，说说它们的不同之处：说说它们的不同之处：课题课题2

12、 2土壤取样，直接稀释。土壤取样，直接稀释。课题课题3 3土壤取样，选择培养，土壤取样，选择培养，增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。1、纤维素分解菌选择培养基、纤维素分解菌选择培养基属于属于_（固体、液体）培（固体、液体）培养基，原因是养基，原因是_【资料二】选择培养【资料二】选择培养阅读资料二阅读资料二“选择培养选择培养”，回答以下几问题：，回答以下几问题：液体液体没有添加琼脂没有添加琼脂2、该培养基对微生物、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是如果具有，其选择机制是_ 具有具有 能分解纤维素的微生物可能分

13、解纤维素的微生物可利用利用纤维素作为碳源而纤维素作为碳源而大量繁殖；大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制其他微生物繁殖被抑制 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。境。 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？应该埋进土壤多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维

14、素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。左右的腐殖土壤中。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤或者将纤维素改为葡萄糖。维素改为葡萄糖。 旁栏思考题旁栏思考题为什么选择培养能为什么选择培养能够够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？ 指微生物的种类少了，而指微生物的种类少了，而某些微生物的数量多了某些微生物的数量多了比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤

15、维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在纤维将细菌涂布在纤维素粉做主要碳源的素粉做主要碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养101102103104105106培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长

16、因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：方法一：方法二：方法二：步步骤骤培养基经涂布培养培养基经涂布培养先先长出菌长出菌落落再再覆盖覆盖1mg/mL的的CR溶溶液液(1015min后后)倒去倒去CR溶溶液液加入加入1mol/L的的NaCl溶液溶液15min后倒掉后倒掉NaCl溶液溶液出现透明圈出现透明圈配置配置10mg/mL的的CR溶液溶液灭菌灭菌按照按照1mLCR溶液溶液/200mL培养培

17、养基的比例基的比例混匀混匀倒平板倒平板接种后接种后培养培养出现透明圈出现透明圈优优点点显示出的颜色基本上是纤显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用维素分解菌的作用操作简便，不存在菌落的混杂问操作简便，不存在菌落的混杂问题题缺缺点点操作繁琐，加入刚果红会操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂使菌落之间发生混杂由于产生淀粉酶的微生物也形由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性成透明圈，所以可能产生假阳性反应。反应。有些微生物具有降解色素的能有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易

18、区分。菌不易区分。两种刚果红染色法的比较两种刚果红染色法的比较：比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维

19、素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶以免出现的透明圈不够

20、清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！当然分解纤维素的能就强！ 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格

21、 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。则说明培养基制作合格。 四、结果分析与评价四、结果分析与评价2. .培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。3. .分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于

22、在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。五、课题延伸五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶

23、的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。3 31 1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发发酵产纤维素酶酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有实验，纤维素酶的发酵方法有 液体液体 发酵和发酵和 固体固体 发酵。发酵。3 32 2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的生的 葡萄糖葡萄糖 含量进行定量测定。含量进行定量测定。分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养扩大扩大培养培养鉴别鉴别培养培养富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量刚果红刚果红染色鉴别染色鉴别挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落课堂总结课堂总结