植物细胞工程课件第五章细胞融合.ppt

1、细胞融合细胞融合Cell Fusion细胞工程电子课件细胞工程电子课件华中农业大学生命科学技术学院华中农业大学生命科学技术学院细胞融合的概念与意义细胞融合的概念与意义融合细胞的制备融合细胞的制备细胞融合的方法细胞融合的方法融合细胞的选择与鉴定融合细胞的选择与鉴定主主要要内内容容 番茄薯番茄薯多利多利白菜白菜甘蓝甘蓝5.1 细胞融合的概念与意义细胞融合的概念与意义 细胞融合（细胞融合（cell fusion） 即细胞杂交（即细胞杂交（cell hybridization），在外力在外力（诱导或促融剂）作用下，两个或两个以上（诱导或促融剂）作用下，两个或两个以上的细胞或原生质体相互接触，从而发生膜

2、融的细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。象。细胞接触细胞接触膜融合膜融合胞质融合胞质融合对称杂种对称杂种（symmetric hybrid）非对称杂种非对称杂种（asymmetric hybrid）胞质杂种胞质杂种 (cybrid)对称融合对称融合（symmetricfusionsymmetricfusion） 非对称融合非对称融合（a asymmetricfusionsymmetricfusion）用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：大类：o物理方法常采用

3、射线处理，如物理方法常采用射线处理，如X X射线、射线、r r射线等，射线等，它们能使细胞核失活；它们能使细胞核失活；o化学处理目前常用的试剂有：化学处理目前常用的试剂有：O核失活碘乙酰胺（核失活碘乙酰胺（IOAIOA）、碘乙酸）、碘乙酸(IA)(IA)；O质失活罗丹明（质失活罗丹明（R-6-GR-6-G）。）。R-6-GR-6-G是一种亲脂染是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。活作用。o对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在一起，相互之间未发生排斥，杂种的体细胞一起，相互之间未发生排斥，杂种

4、的体细胞染色体数目为双亲之和，其外部形态呈中间染色体数目为双亲之和，其外部形态呈中间类型。类型。 结果在导入有用基因的同时，也带入了结果在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因（或性状），一个杂种亲本的全部不利基因（或性状），一个杂种中有两套不尽相关的基因并不是试验所期望中有两套不尽相关的基因并不是试验所期望的，这样常导致部分或完全不育，因而难以的，这样常导致部分或完全不育，因而难以形成育种上的有用材料。形成育种上的有用材料。o不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一方的

5、部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，正常花粉粒极少，育性低。正常花粉粒极少，育性低。o胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的细胞质。细胞质。细胞融合的意义细胞融合的意义 实现远缘遗传重组实现远缘遗传重组 创造新的遗传型创造新的遗传型 转移抗逆性状，改良作物品质转移抗逆性状，改良作物品质 通过原生质体融合转移细胞质基因控制通过原生质体融合转移细胞质基因控制的

6、性状的性状植植物物next 第一个体细胞杂种第一个体细胞杂种 (Carlson(Carlson，1972)1972) 第一个第一个属间体细胞杂种属间体细胞杂种Pomato Pomato （MelchersMelchers，19781978） 禾本科禾本科 eg.籼稻与野生稻籼稻与野生稻 木本植物木本植物 eg. 柑橘柑橘PotatoTomatoPomato+据不完全统计，通过据不完全统计，通过体细胞杂交至少已获体细胞杂交至少已获得得4444个种内，个种内，103103个个同属异同属异种，种， 4848个属间，个属间，5 5个科间的细胞杂种个科间的细胞杂种，其中非对称融合的体，其中非对称融合的体

7、细胞杂种在细胞杂种在90%90%以上。（李杰等，以上。（李杰等，20032003） 19801980年，年，ButenkoButenko、KuchkoKuchko获获得抗得抗Y Y病毒的马铃薯杂种植株。病毒的马铃薯杂种植株。中国农业科学院烟草研究所得中国农业科学院烟草研究所得到品质优良、兼抗多种病害的烟到品质优良、兼抗多种病害的烟草新品系。草新品系。 用于单克隆抗体、核酸疫苗制备，为大规模生用于单克隆抗体、核酸疫苗制备，为大规模生产特定生物制品培育种子细胞。产特定生物制品培育种子细胞。 动物个体克隆，培育动物新品种，使牲畜迅速动物个体克隆，培育动物新品种，使牲畜迅速实现良种化。实现良种化。 在

8、基础理论研究上在基础理论研究上 动物细胞融合技术对研究动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制与诊治等细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制与诊治等方面都有重要意义。方面都有重要意义。细胞融合的意义细胞融合的意义动动物物The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies Georges J.F. Koehler Federal Republic of Germany Basel Institute

9、for Immunology Basel, Switzerland b. 1946 d. 1995 Car Milstein Argentina and United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom b. 1927(in Bahia Blanca, Argentina)d. 2002 5.2 融合细胞的制备融合细胞的制备5.2.1 植物原生质体的制备植物原生质体的制备原生质体原生质体(protoplast) 除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围

10、的裸露细胞。露细胞。 Isolated protoplasts have been described as naked cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed. 18801880年，年，HansteinHanstein首次起用首次起用原生质体原生质体(protoplast)(protoplast)一词。一词。

11、亚原生质体亚原生质体(subprotoplast) 核质体核质体(nuclearplast) 胞质体（胞质体（cytoplast）原原生生质质体体的的分分离离基础材料准备基础材料准备预处理与酶解预处理与酶解原生质体活力测定原生质体活力测定原生质体收集与纯化原生质体收集与纯化用于分离原生质体的材料准备用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片无菌试管苗叶片子叶和下胚轴子叶和下胚轴愈伤组织和培养细胞愈伤组织和培养细胞 预处理及酶解预处理及酶解预处理预处理酶解酶解酶酶渗透压渗透压 调节剂调节剂 酶的种类酶的种类v 纤维素酶（纤维素酶（Cellulase）v 半纤维素酶（半纤维素酶（Hemicellu

12、lase）v 果胶酶（果胶酶（Pectinase） v 溶剂：原生质体培养基或特殊配制。溶剂：原生质体培养基或特殊配制。v 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。醇等。 酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压 酶处理酶处理 酶解温度酶解温度酶浓度酶浓度酶解时间酶解时间原生质体游离原生质体游离 沉淀法沉淀法 原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化 飘浮法飘浮法 界面法界面法采用漂浮法分离形成的原生质体带0.6ml含原生质体含原生质体悬浮液悬浮液12ml0.45mol/L甘露醇甘露醇400g 5min0.45mol/L蔗糖蔗糖碎片带碎片带（比原（比原生质体轻）生质体

13、轻）含原生质体带含原生质体带以柑桔为例以柑桔为例25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液果胶酶果胶酶纤维素酶纤维素酶过滤、离心过滤、离心 原生质体活力测定原生质体活力测定目测法目测法在显微镜下观察，在显微镜下观察，根据细胞形态、流根据细胞形态、流动性确定原生质体动性确定原生质体活力。活力。 FDAFDA（二乙酸荧光素）法（二乙酸荧光素）法 机理？机理？有活力的有活力的Protoplast发荧光发荧光无活力的无活力的Protoplast被染色被染色伊凡蓝法伊凡蓝法 机理？机理？影响原生质体影响原生质体活力的因素活力的因素分离材料的分离材料的生理状态生理状态酶解条件酶解条件酶质量、浓度、酶

14、质量、浓度、酶解温度、酶酶解温度、酶解时间、酶溶解时间、酶溶液的渗透压液的渗透压分离条件分离条件离心次数、离离心次数、离心速度、纯化心速度、纯化方法、分离持方法、分离持续时间续时间环境条件环境条件操作环境的温操作环境的温度、分离用具度、分离用具的影响的影响5.2.2 动物单细胞的制备动物单细胞的制备 用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分散的细胞。散的细胞。自发融合自发融合诱发融合诱发融合NaNONaNO3 3高高pH-pH-高高CaCa离子离子仙台病毒仙台病毒PEGPEG电场电场5.

15、3 细胞融合的方法细胞融合的方法5.3.1 生物融合法生物融合法-仙台病毒法仙台病毒法 病毒类是研究得最早的促融剂病毒类是研究得最早的促融剂 疱疹病毒、天花病毒、副流感型疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能诱导细胞融合病毒，都能诱导细胞融合 毒性大，应用受到限制毒性大，应用受到限制 德国生理学家德国生理学家 Johannes Mller Johannes Mller 1801-1858 1801-1858 1958年，日本学者冈田善雄年，日本学者冈田善雄（Okada）发现了）发现了HVJ病毒可促病毒可促进细胞融合。进细胞融合。 仙台病毒

16、（仙台病毒（HVJ）毒力低，对人）毒力低，对人的危害小的危害小 易被紫外线或易被紫外线或丙炔内酯所灭丙炔内酯所灭活活日本学者日本学者OkadaOkada诱导细胞融合的不诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的是仙台病毒内部的 RNA，而是它的外，而是它的外膜。膜。 不同细胞融合速度不同，快的不同细胞融合速度不同，快的370C中中5min即可。即可。 细胞的融合与病毒的数量、温度有关。细胞的融合与病毒的数量、温度有关。 每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。胞膜上，细胞才能凝集。 融合要在较高的温度中进行，一般是融合要在较高的温度中进行，一般是

17、370C。 融合成本低，勿需特殊设备；融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高；融合子产生的异核率较高； 融合过程不受物种限制。融合过程不受物种限制。5.3.2 化学融合法化学融合法-PEG法法PEG诱导融合的特点诱导融合的特点桥梁桥梁PEG被洗掉被洗掉+-+-+-+-电荷重排电荷重排原生质体膜接触原生质体膜接触融合融合+-+-+-+-+-+-PEG的的作作用用机机理理 融合液融合液：CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6 诱导液诱导液：融合液融合液PEG 2045 稀释液稀释液：A液（液（g

18、/100ml）pH6.0 B液（液（g/100ml） pH10.5 葡萄糖葡萄糖 7.21 甘氨酸甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169P1P2P1 P2 混合静止混合静止1min.融融 合合融合液融合液加入加入PEG稀稀 释释洗洗 涤涤加入稀释液加入稀释液加入培养基加入培养基培培 养养选选 择择洋葱根尖原生质体洋葱根尖原生质体（40） 烟草叶肉原生质体烟草叶肉原生质体 （4040） 烟草叶肉细胞和洋葱根烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合尖细胞原生质体融合 烟草叶肉和洋葱根尖细烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合胞原生质体的异源融合 PEG融合的融合的

19、影响因素影响因素原生质体的原生质体的群体密度群体密度PEG的相对的相对分子量与含量分子量与含量Ca2+浓度浓度和和pH值值融合液的渗融合液的渗透压和温度透压和温度培养时间培养时间其他其他-的原生的原生质体悬浮液形成质体悬浮液形成的异核体频率最的异核体频率最高。高。PEG6000效果较效果较好；含量以好；含量以-较为适较为适宜。宜。Ca2+可提高可提高PEG诱导频率；同时诱导频率；同时与与pH值相关。值相关。甘露醇浓度为甘露醇浓度为0.4mol/L0.7mol/L范围内。保温温度范围内。保温温度一般在一般在C左右。左右。NO3-/NH4+;与与DMSO并用并用异核发生率第异核发生率第四天达高峰，

20、四天达高峰，之后下降。之后下降。电融合法（电融合法（electrofusion technique）是）是20世纪世纪80年代发展起来的细胞融合技术，以年代发展起来的细胞融合技术，以电降解及双向电泳的联合作用为基础。电降解及双向电泳的联合作用为基础。5.3.3 物理融合法物理融合法-电融合法电融合法 电融合过程的分子机制电融合过程的分子机制+-+-+-+-+-+-负极负极正极正极+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-烟草原生质体（烟草原生质体（40）原生质体成串（原生质体成串（40）原生质体融合原生质体融合 电融合仪的结构特点电融合仪的结构特点交变电场

21、部分交变电场部分 高频直流电击部分高频直流电击部分电融合的电融合的影响因素影响因素基因型基因型原生质体原生质体的密度的密度Ca2+浓度浓度交变电场交变电场强度强度直流高电直流高电压脉冲压脉冲电融合法的优点：电融合法的优点： 融合技术操作简便。融合技术操作简便。 不存在对细胞的毒害问题；不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高；融合效率高；其他方法其他方法激光诱导细胞融合法激光诱导细胞融合法空间细胞融合技术空间细胞融合技术离子束细胞融合技术离子束细胞融合技术5.4 融合细胞的选择与鉴定融合细胞的选择与鉴定细胞融合的方式细胞融合的方式细胞融合的产物细胞融合的产物自体融合自体融合异体融合异体融合同核体（

22、同核体（homokaryonhomokaryon）异核体（异核体（heterokaryonheterokaryon）5.4.1 动物融合细胞的选择培养技术动物融合细胞的选择培养技术方方法法细胞的形态大小细胞的形态大小细胞繁殖细胞繁殖状态上的差异状态上的差异融合细胞对温度、药物的融合细胞对温度、药物的敏感性、营养要求不同等敏感性、营养要求不同等次黄嘌呤鸟嘌呤次黄嘌呤鸟嘌呤核糖磷酸转移酶核糖磷酸转移酶缺失型细胞株缺失型细胞株（含有次黄嘌呤含有次黄嘌呤H，氨基喋呤，氨基喋呤A和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶T）HGPRG-otherHAT培养基培养基次黄嘌呤胸腺嘧次黄嘌呤胸腺嘧啶核糖磷酸转移啶核糖磷酸转移酶缺失

23、型细胞株酶缺失型细胞株（含有次黄嘌呤（含有次黄嘌呤H，氨基喋呤氨基喋呤A和和5-甲甲基脱氧胞苷基脱氧胞苷M）HGPRT-dcD-HAM培养基培养基植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞杂交过程示意图(1)(1)(2)(3)(4)(5)5.4.2 植物体细胞杂种选择与鉴定植物体细胞杂种选择与鉴定 杂种细胞杂种细胞选择系统选择系统形态特征选择形态特征选择互补选择互补选择荧光标记选择荧光标记选择生长特性选择生长特性选择next 形态特征选择（形态特征选择（morphology trait selection) 根据细胞或原生质体的大小、颜色、漂浮根据细胞或原生质体的大小、颜色、漂浮密度、电泳迁移速率、细

24、胞繁殖状态上的密度、电泳迁移速率、细胞繁殖状态上的差异等进行选择。差异等进行选择。 大豆下胚轴大豆下胚轴原生质体原生质体烟草叶肉烟草叶肉原生质体原生质体一半含有叶绿素，一半含有叶绿素，另一半含淀粉粒另一半含淀粉粒补充糖补充糖生长特性选择（生长特性选择（growth trait selection)eg1.粉蓝烟草粉蓝烟草郎氏烟草郎氏烟草无生长素无生长素Carlson ， 1972eg2. 互补选择（互补选择（complenetary selectioncomplenetary selection）v 抗性互补（抗性互补（resistande complenetary resistande co

25、mplenetary selection)selection)v 营 养 缺 陷 型 互 补 （营 养 缺 陷 型 互 补 （ a u x o t r o p h a u x o t r o p h complemetary selectioncomplemetary selection）v 遗传互补（遗传互补（genetic complemetary genetic complemetary selectionselection） Nicotiana sylvestrisNicotiana knightiana抗卡那霉素、抗卡那霉素、失去再生植失去再生植株能力株能力有生长有生长Callus能

26、力、但从未能力、但从未形成植株形成植株卡那霉素卡那霉素eg1.eg2. 两个不同类型的硝酸还原酶缺失突变两个不同类型的硝酸还原酶缺失突变体烟草融合，二亲本均不能在在硝酸盐体烟草融合，二亲本均不能在在硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，而杂种细为唯一氮源的培养基上生长，而杂种细胞则可以生长（胞则可以生长（Glimelius ， 1978 ）。）。 荧光标记选择荧光标记选择：亲本标记不同荧光：亲本标记不同荧光 eg. 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗）和异硫氰酸罗丹明（丹明（RITC）分别发出绿色和红色）分别发出绿色和红色2体细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定形态鉴定形态鉴定细胞学鉴定细胞学鉴定生化鉴定生化鉴定分子鉴定分子鉴定根据双亲的形根据双亲的形态学性状观察态学性状观察进行鉴定。进行鉴定。细胞器鉴定、细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体鉴定。同功酶鉴定。同功酶鉴定。RFLP鉴定、鉴定、RAPD标记鉴标记鉴定。定。18条染色体条染色体36条染色体条染色体RAPD带型带型RAPD带型带型思考题思考题 原生质体定义原生质体定义 原生质体分离、纯化方法原生质体分离、纯化方法 原生质体融合方法及原理原生质体融合方法及原理 原生质体融合的意义原生质体融合的意义 体细胞杂种鉴定方法体细胞杂种鉴定方法 体细胞杂种应用实例体细胞杂种应用实例