动物细胞工程-PPT课件.ppt

1、2022-5-18邓邓 宁宁 副教授副教授暨南大学生命科学技术学院暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心抗体工程研究中心动物细胞工程动物细胞工程2005邓 宁第一章第一章 序论序论第二章第二章 动物细胞培养动物细胞培养第三章第三章 细胞融合细胞融合第四章第四章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体一、细胞篇一、细胞篇2005邓 宁第一讲第一讲 概概 论论掌握内容：掌握内容：概念：概念：生物工程，细胞工程生物工程，细胞工程，细胞拆合，细胞拆合，干细胞，转基因动物干细胞，转基因动物动物细胞工程包含哪些研究内容动物细胞工程包含哪些研究内容 2005邓 宁生物工程生物工程生物技术（生

2、物工艺学）：是以生命生物技术（生物工艺学）：是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。也就生物制品和创造新物种的一门综合技术。也就是利用生物有机体或其组成部分发展新工艺或是利用生物有机体或其组成部分发展新工艺或制造新产品的一种科学技术。制造新产品的一种科学技术。 2005邓 宁生物工程被誉为古今新技术革命的前沿技术生物工程被誉为古今新技术革命的前沿技术之一，许多国家都把生物工程列为优先发展之一，许多国家都把生物工程列为优先发展的技术，人们预计，的技术，人们预计，下个世纪是生物工程的下个世纪是生物工程的年代。年代。

3、2005邓 宁生物工程的发展历史生物工程的发展历史 第一代生物工程第一代生物工程 1857年巴斯德证实酒精发酵是由活酵母引起 19世纪末到20世纪30年代，不少工业发酵的出现，以工业微生物工程生产发酵产品为代表的真正意义的生物工程正式诞生。2005邓 宁近代生物工程近代生物工程 19281928年弗来明发明青霉素，年弗来明发明青霉素，19431943年开发出年开发出青霉素的生产工艺青霉素的生产工艺现代生物工程现代生物工程 2020世纪世纪7070年代，随着基因重组、细胞和年代，随着基因重组、细胞和组织培养、酶的固定化、动植物细胞的大规模组织培养、酶的固定化、动植物细胞的大规模培养、现代生物反应

4、器和计算机等技术的应用，培养、现代生物反应器和计算机等技术的应用，生物工程进入到新的发展阶段生物工程进入到新的发展阶段 DNADNA重组、细胞融合等技术重组、细胞融合等技术 克隆羊克隆羊“多莉多莉”的诞生的诞生2005邓 宁基因工程基因工程生物工程四大领域生物工程四大领域细胞工程细胞工程发酵工程发酵工程酶工程酶工程酶工程蛋白质工程细胞工程基因工程发酵工程生物化学 工程天然 微生物动植物细胞或组织，融合细胞或微生物转基因基因 工程菌基因融合与修饰新蛋白质酶制剂 或活细胞工业化生物产品或医药、环保、能源、材料等领域的应用微生物工程生物工程六个组成技术之间的关系图解2005邓 宁二、动物细胞工程的发

5、展和内容1977年荷兰科学家年荷兰科学家列文虎克列文虎克 证实了细菌、精子的细胞结构证实了细菌、精子的细胞结构19世纪世纪80年代，德国学者年代，德国学者施旺和施莱登施旺和施莱登提出细胞学说提出细胞学说2005邓 宁 利用离体细胞培养细胞进行的研究发现利用离体细胞培养细胞进行的研究发现, ,通过通过细胞融合、细胞拆合、核质移植、染色体分离与细胞融合、细胞拆合、核质移植、染色体分离与显微切割和染色体转移技术显微切割和染色体转移技术的应用都可以明显改的应用都可以明显改变一种细胞的变一种细胞的遗传性状和生物学特性遗传性状和生物学特性。这种改变。这种改变是通过细胞遗传物质的转移、置换而发生的。这是通过

6、细胞遗传物质的转移、置换而发生的。这些利用培养细胞在细胞水平上改变细胞遗传性状些利用培养细胞在细胞水平上改变细胞遗传性状的成功为细胞工程的兴起和发展奠定了基础的成功为细胞工程的兴起和发展奠定了基础2005邓 宁 细胞工程细胞工程就是应用生物学和分子生物学的方就是应用生物学和分子生物学的方法法, ,在细胞水平进行的遗传操作在细胞水平进行的遗传操作, ,改变细胞的遗改变细胞的遗传特性和生物学特性传特性和生物学特性，以获得具有特定生物学，以获得具有特定生物学特性的细胞和生物个体的技术。特性的细胞和生物个体的技术。 简单地说，它是应用细胞生物学和分子生物简单地说，它是应用细胞生物学和分子生物学等学科的

7、理论和技术按照人们的需要，有计学等学科的理论和技术按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细胞以获得生物划地大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传以及其产品，或改变细胞的遗传以产生新的种或产生新的种或品种。品种。 组织与细胞培养技术组织与细胞培养技术实验研究、产前诊断、细实验研究、产前诊断、细胞产物。胞产物。 细胞融合技术细胞融合技术 单克隆抗体、创造新品种、基因单克隆抗体、创造新品种、基因分析。分析。 细胞大量培养技术细胞大量培养技术 名贵药物、生物制品。名贵药物、生物制品。 染色体工程技术染色体工程技术 创造作物新类型。创造作物新类型。 细胞器移植技术细胞器移

8、植技术 创造动植物新品种。创造动植物新品种。 核质移植技术、体外受精和胚胎移植技术核质移植技术、体外受精和胚胎移植技术人类人类优生、动植物改良优生、动植物改良 基因重组技术基因重组技术 外源基因导入技术外源基因导入技术 物理，化学技术物理，化学技术细细 胞胞 工工 程程动植物改良，基因治疗2005邓 宁细细 胞胞 工工 程程细胞整体水平（细胞培养、细胞融合）细胞整体水平（细胞培养、细胞融合）细胞器水平（核移植，改变染色体倍细胞器水平（核移植，改变染色体倍 性和组成）性和组成）基因水平（外源基因导入）基因水平（外源基因导入）2005邓 宁 动物细胞工程是建立在动物细胞工程是建立在动物细胞培养、动

9、物细胞培养、细胞融合和细胞拆合细胞融合和细胞拆合技术基础上发展起来技术基础上发展起来的。随着基因工程技术、基因转移技术和的。随着基因工程技术、基因转移技术和干细胞工程技术的发展，动物细胞工程在干细胞工程技术的发展，动物细胞工程在理论和应用两方面获得快速发展。理论和应用两方面获得快速发展。 1 1、动物细胞培养、动物细胞培养2005邓 宁2 2、细胞融合和单克隆抗体技术、细胞融合和单克隆抗体技术 20 20世纪世纪6060年代，科学家发现细胞融合现象年代，科学家发现细胞融合现象 细胞融合可以细胞融合可以在不同细胞间或不同种、在不同细胞间或不同种、不同类型细胞间发生，产生不同类型细胞间发生，产生异

10、核体异核体 细胞融合技术的最大发展和应用就是细胞融合技术的最大发展和应用就是杂杂交瘤技术。交瘤技术。2005邓 宁2005邓 宁三、细胞拆合、核移植和动物克隆三、细胞拆合、核移植和动物克隆 细胞拆合细胞拆合把完整细胞的细胞核和细胞质用特殊把完整细胞的细胞核和细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。育新的细胞或新的生物个体。 细胞重组技术细胞重组技术

11、是现代生物工程中瞩目的热是现代生物工程中瞩目的热点课题，细胞重组结合基因转移可以人为地使细点课题，细胞重组结合基因转移可以人为地使细表达新的性状和产生新的产物。表达新的性状和产生新的产物。2005邓 宁芬兰多赛特白羊芬兰多赛特白羊苏格兰黑苏格兰黑面母绵羊面母绵羊核供体核供体卵供体卵供体乳腺细胞乳腺细胞饥饿培养饥饿培养去核去核电融合电融合新的新的 卵细胞卵细胞桑椹胚或囊胚桑椹胚或囊胚假孕母养假孕母养多莉多莉2005邓 宁 克隆羊多莉的诞生克隆羊多莉的诞生 第一，它证明了一个已经第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息仍然保持着当初胚胎

12、细胞的全部遗传信息，并且经此并且经此技术处理后，体细肥恢复了失去的全能性形成完整个技术处理后，体细肥恢复了失去的全能性形成完整个体。这就是说哺乳动物业已分化的细胞不具有细胞全体。这就是说哺乳动物业已分化的细胞不具有细胞全能性的传统概念，在一定条件下是可逆的。能性的传统概念，在一定条件下是可逆的。 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。 第三，在现代生物学领域中，没有任何一项究成果第三，在现代生物学领域中，没有任何一项究成果能够比通过对基因进行有规律地控制

13、而解决更多的问能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。题的先例。2005邓 宁4 4、基因转移和转基因动物、基因转移和转基因动物 将特定的目的基因从某一动物或其他生物中分将特定的目的基因从某一动物或其他生物中分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称外源基因的动物称转

14、基因动物转基因动物（transgenetictransgenetic animalanimal）。）。2005邓 宁5 5、干细胞工程和再生医学、干细胞工程和再生医学 胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESembryonic stem cell, ES） 是从早期胚胎内细胞团（是从早期胚胎内细胞团（ICMICM）分离出来的，）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞多能细胞。它与早期胚胎聚集，或注射到胚胎后能参与宿它与早期胚胎聚集，或注射到胚胎后能参与宿主胚胎的发育，而分化为成体动物的所有组织主胚胎的发育，而分化为成体动物的

15、所有组织（包括生殖细胞）。（包括生殖细胞）。 2005邓 宁三、动物细胞工程的应用三、动物细胞工程的应用 动物细胞工程不仅广泛应用予生物科学各基动物细胞工程不仅广泛应用予生物科学各基础学科领域的研究，为生命科学提供从分子水平、础学科领域的研究，为生命科学提供从分子水平、细胞水平和整体水平探索生命的遗传控制的有效手细胞水平和整体水平探索生命的遗传控制的有效手段和方法，同时也发展成为生物工程和生物医学产段和方法，同时也发展成为生物工程和生物医学产业的主要支柱，为人类改造自然、创造优良生物品业的主要支柱，为人类改造自然、创造优良生物品种、生产生物药物、保障人类健康展示了广阔的应种、生产生物药物、保障

16、人类健康展示了广阔的应用前景。用前景。2005邓 宁1、细胞融合和单克隆抗体的应用、细胞融合和单克隆抗体的应用 细胞融合技术是真核细胞基因表达与分化机制研细胞融合技术是真核细胞基因表达与分化机制研究的有效途径之一。究的有效途径之一。 细胞融合技术中，用的最广的是建立淋巴细胞细胞融合技术中，用的最广的是建立淋巴细胞杂交瘤杂交瘤2005邓 宁 二、转基因技术的应用二、转基因技术的应用 转基因技术的是基因结构和功能研究的有转基因技术的是基因结构和功能研究的有效手段。效手段。 转基因动物转基因动物提供了一个体内研究基因结构、提供了一个体内研究基因结构、功能的模型，借助基因工程操作。对功能的模型，借助基

17、因工程操作。对目的基因目的基因的改造、基因敲除和敲入的改造、基因敲除和敲入的研究，是研究基因的研究，是研究基因在发育和疾病中作用的新途径。建立转基因疾在发育和疾病中作用的新途径。建立转基因疾病动物模型，入遗传病、病毒性疾病、肿瘤、病动物模型，入遗传病、病毒性疾病、肿瘤、血液病、老年病、免疫功能疾病、糖尿病等，血液病、老年病、免疫功能疾病、糖尿病等，是研究疾病发生、发展的理想工具。是研究疾病发生、发展的理想工具。2005邓 宁三、细胞治疗三、细胞治疗 干细胞研究证明，胚胎干细胞可定向分化为需要的干细胞研究证明，胚胎干细胞可定向分化为需要的特殊类型的体细胞，并具有体外增值的能力。将增值特殊类型的体

18、细胞，并具有体外增值的能力。将增值的细胞移植到受损的组织，可能修复或取代受损组织、的细胞移植到受损的组织，可能修复或取代受损组织、器官。器官。 神经干细胞治疗帕金森病，胚胎干细胞治疗遗传性神经干细胞治疗帕金森病，胚胎干细胞治疗遗传性或损伤性骨病。肝干细胞治疗肝病等或损伤性骨病。肝干细胞治疗肝病等2005邓 宁 胚胎干细胞的应用胚胎干细胞的应用（1 1）生产转基因动物）生产转基因动物在细胞水平上进行外源基因整合筛选，在细胞水平上进行外源基因整合筛选，ESCESC中端粒酶具有活性中端粒酶具有活性（2 2）生产克隆动物）生产克隆动物（3 3）发育生物学的理想体外模型系统）发育生物学的理想体外模型系统

19、哺乳动物的胚胎在体内发育，正常情况下无法进行跟踪观察哺乳动物的胚胎在体内发育，正常情况下无法进行跟踪观察（4 4）医药领域的应用）医药领域的应用新型药物的发现，筛选新型药物的发现，筛选细胞，组织和器官的修复和移植治疗或细胞工程的种子细胞细胞，组织和器官的修复和移植治疗或细胞工程的种子细胞2005邓 宁主要参考书目：主要参考书目：动物细胞工程动物细胞工程，徐永华，化学工业出版社，徐永华，化学工业出版社细胞工程细胞工程，李志勇，科学出版社，李志勇，科学出版社医用细胞工程医用细胞工程（第二版），杨吉成等，上海交通（第二版），杨吉成等，上海交通大学出版社大学出版社培养细胞学与细胞培养技术培养细胞学与细

20、胞培养技术，张卓然，上海科学，张卓然，上海科学出版社出版社细胞实验指南细胞实验指南(上下上下)，D.L.斯佩克特斯佩克特(美美)，科学出科学出版社发行处版社发行处干细胞技术干细胞技术，裴雪涛裴雪涛，化学工业出版社化学工业出版社组织培养和分子细胞学技术组织培养和分子细胞学技术，鄂征鄂征，北京出版社北京出版社2005邓 宁相关杂志：相关杂志：细胞生物学杂志细胞生物学杂志 ，中国细胞生物学学会主办，中国细胞生物学学会主办，中国科学院上海细胞生物学研究所承办中国科学院上海细胞生物学研究所承办 生命科学生命科学 ，中国科学院上海文献情报中心主办中国科学院上海文献情报中心主办细胞与分子免疫学杂志细胞与分子

21、免疫学杂志，中国免疫学会和第四中国免疫学会和第四军医大学共同主办军医大学共同主办中国组织化学与细胞化学杂志中国组织化学与细胞化学杂志网站网站：中国干细胞网中国干细胞网 http:/ http:/ 2005邓 宁 概念：概念：细胞培养，组织培养，原代培养，细胞培养，组织培养，原代培养，传代培养，细胞系，细胞株传代培养，细胞系，细胞株 细胞培养实验室必须的设备有哪些？细胞培养实验室必须的设备有哪些？2.2. 培养基必须具有哪些基本条件培养基必须具有哪些基本条件3.3. 传代培养和原代培养的实验过程传代培养和原代培养的实验过程4.4. 细胞的冻存与复苏的过程细胞的冻存与复苏的过程5.5. 细胞污染的

22、检测与预防细胞污染的检测与预防第二章第二章 动物细胞培养动物细胞培养2005邓 宁二、组织（细胞）培养技术及其历史二、组织（细胞）培养技术及其历史 动物细胞培养动物细胞培养( (亦称组织培养亦称组织培养) )既有别既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同不同. .2005邓 宁 “细胞培养细胞培养( (cell culture)”cell culture)”指的是细指的是细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成，组织；细胞不再形成，组织； “组织培养组织培养( (tissue culture)”

23、tissue culture)”指的是指的是组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构成功能组织分化并保持组织的结构成功能 ； 2005邓 宁“器官培养器官培养( (organ culture)”organ culture)”则是指则是指器官的胚芽、整个器官或器官的一部份器官的胚芽、整个器官或器官的一部份在体外条件下的保存或生长、此时也能在体外条件下的保存或生长、此时也能有器官的分化并保持器官的立体结构或有器官的分化并保持器官的立体结构或功能。功能。2005邓 宁 (1) (1)细胞培养细胞培养细胞细胞( (包括单个细包括单个细胞胞

24、) )在体外条件下的生长称为细胞培养。在体外条件下的生长称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织。在细胞培养中，细胞不再形成组织。2005邓 宁 （2 2）贴壁依赖性细胞或培养物贴壁依赖性细胞或培养物由他们繁衍出来的细胞或培养物只有由他们繁衍出来的细胞或培养物只有贴附于不定化学作用的物体贴附于不定化学作用的物体( (如玻璃或塑如玻璃或塑料等无活性物体料等无活性物体) )的表面时，才能生长、的表面时，才能生长、生存或维持其功能。生存或维持其功能。2005邓 宁 (3) (3)无菌的无菌的在培养物中不存在真菌、在培养物中不存在真菌、细菌、病毒、支原体或其它微生物。细菌、病毒、支原体或其它微生物

25、。 (4)(4)细胞一代时间细胞一代时间单个细胞两次单个细胞两次 连续分裂的时间间隔连续分裂的时间间隔 (5)(5)细胞杂交细胞杂交两个或多两个或多4 4不同的细胞不同的细胞融合，导致一个合核体的形成。融合，导致一个合核体的形成。2005邓 宁2005邓 宁 细胞株细胞株(cell strain)(cell strain) 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株。从培养代数来讲,可培养到40-50代以上。2005邓 宁 细胞传代培养方法：细胞传代培养方法： 分离细胞培养物：分离细胞培养物： 从温箱中取出瓶壁上铺满单层细胞的培养从温箱中取出瓶壁上

26、铺满单层细胞的培养瓶，倒掉其中剩余的培养液，先用瓶，倒掉其中剩余的培养液，先用HanksHanks液洗二次，加入胰酶（或液洗二次，加入胰酶（或EDTAEDTA）消化液，）消化液，放入放入37C37C温箱温箱( (有的细胞可以不放有的细胞可以不放) )，时间可，时间可由几十秒至十几分钟，要根据细胞种类而由几十秒至十几分钟，要根据细胞种类而定。定。2005邓 宁 悬浮培养物：悬浮培养物： 倒掉消化液，以倒掉消化液，以HanksHanks液洗一次，液洗一次， 补加新鲜培养液；用弯滴管轻吹瓶壁，补加新鲜培养液；用弯滴管轻吹瓶壁，使得细胞浮在培养液内使得细胞浮在培养液内 根据细胞数量分几瓶，加入培养液继

27、续根据细胞数量分几瓶，加入培养液继续培养。培养。 2005邓 宁 代：代： 细胞以一个培养瓶移至另一个培养细胞以一个培养瓶移至另一个培养瓶，由此培养液有所稀释，即称为瓶，由此培养液有所稀释，即称为“一代一代”。2005邓 宁（8 8）克隆克隆单个细胞通过有丝分裂形成单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。的细胞群体。（9 9）汇合汇合指在瓶中培养的细胞彼此汇指在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层合形成单层2005邓 宁（1010）上皮样细胞上皮样细胞与上皮细胞在形与上皮细胞在形态和外观上相似的态和外观上相似的细胞称为上皮样细细胞称为上皮样细胞胞2005邓 宁 （1111）成纤维样细成纤维样细胞胞与成纤

28、维细胞与成纤维细胞在形态上和外观上相在形态上和外观上相似的细胞称为成纤维似的细胞称为成纤维样细胞样细胞2005邓 宁（1212）传代传代无论是否稀释，将细胞从无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养即称为传代或传代培养（1313）原代培养原代培养以直接取自生物体以直接取自生物体细胞组织或器官开始的培养细胞组织或器官开始的培养2005邓 宁（1414）群体群体在对数时间生长期进计算在对数时间生长期进计算的细胞增加一倍所需要的时间。如从的细胞增加一倍所需要的时间。如从1.01.010106 6细胞的时间间隔；该术语与细细胞的时间

29、间隔；该术语与细胞干代时间非同义词胞干代时间非同义词2005邓 宁 （1515）群体倍增水平群体倍增水平细胞或细胞株自细胞或细胞株自 体外培养开始后其群体倍增的估计次数体外培养开始后其群体倍增的估计次数 计算公式群体倍增量计数计算公式群体倍增量计数= =loglog1010（N/NN/N0 0)x3.3)x3.3 N N培养瓶中的细胞总数；培养瓶中的细胞总数； N N0 0= =接种到该培养瓶中的细胞数。接种到该培养瓶中的细胞数。2005邓 宁 （1616）异核体异核体通常由于细胞融合的结通常由于细胞融合的结果，在同一胞浆内存在遗传性不同的核，果，在同一胞浆内存在遗传性不同的核，而不管它们的数

30、目多久。而不管它们的数目多久。 2005邓 宁 （1717）同核体同核体通常由于细胞与细胞融通常由于细胞与细胞融合的结果，在共有胞浆内存在遗传性相合的结果，在共有胞浆内存在遗传性相同的核，而不管它们的数目多少实际同的核，而不管它们的数目多少实际应用时应该通过核型分桥来确定细胞核应用时应该通过核型分桥来确定细胞核事实上有相同的核染色体事实上有相同的核染色体2005邓 宁（1818）二倍体细胞系（株）二倍体细胞系（株）二倍体细胞二倍体细胞系（株）内，至少有系（株）内，至少有7070的细胞具有与他来的细胞具有与他来源物种的正常细胞同样的核型。二倍体系源物种的正常细胞同样的核型。二倍体系（株）的寿命是

31、有限的，如人胚细胞可以传（株）的寿命是有限的，如人胚细胞可以传50501010代。鸡胚细胞代。鸡胚细胞15-3515-35代，小鼠代，小鼠14-1814-18代，人胚肾代，人胚肾8-108-10代。代。 二倍体细胞系（株）可以通过自发、病毒、二倍体细胞系（株）可以通过自发、病毒、化学试剂、放射线、癌基因转移等方式转化化学试剂、放射线、癌基因转移等方式转化为连续细胞系（株）为连续细胞系（株）2005邓 宁三、细胞培养及其应用三、细胞培养及其应用 传代培养：传代培养：n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。n 原代培养原代培养n 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在

32、传代之前称为原代培养。n 2005邓 宁1、培养细胞的种类n体外培养的细胞概括分为两类：n1. 上皮细胞或类上皮细胞n正常上批细胞几乎不可能建系。n中国建成的正常上皮细胞系有：HL7702（人肝），和SL（人肺）上批细胞系2005邓 宁培养细胞的特征n 培养细胞的生长方式n贴附生长：n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞n悬浮生长：n 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞2005邓 宁每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）2005邓 宁n游离期：n 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回

33、缩，胞体呈圆球形。n 10分钟一4小时2005邓 宁n贴壁期：n 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）2005邓 宁2005邓 宁2005邓 宁n潜伏期n 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一n般为624小时。2005邓 宁n对数生长期：n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。2005邓 宁n

34、停止期（平台期）：n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n 机制：接触抑制、密度依赖性2005邓 宁2005邓 宁 动物细胞的体外培养，根本特点是模拟动物细胞的体外培养，根本特点是模拟体内的条件，因此，其重要的条件可以体内的条件，因此，其重要的条件可以概括为概括为无菌、生长环境无菌、生长环境(PH(PH值、温度值、温度) )和和营养营养三个方面。三个方面。二、二、动物细胞的体外培养的条件动物细胞的体外培养的条件2005邓 宁 与多数哺乳动物体内温度相似，培养细胞的与多数哺乳动物体内温度相似，培养细胞的最最适温度为适温度为3737o oC C+0.5+0.5o oC C，偏离此温度，细胞的正

35、，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。实常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。实践证明，细胞对低温的耐受性要比对高温的耐践证明，细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些，低温下会使细胞生长代谢速率降低；受性强些，低温下会使细胞生长代谢速率降低；一经恢复正常温度时，细胞会再行生长。若在一经恢复正常温度时，细胞会再行生长。若在4040o oC C左右，则在几小时内细胞便会死亡。因此左右，则在几小时内细胞便会死亡。因此高温对细的威胁甚大高温对细的威胁甚大。 2005邓 宁 细胞培养的细胞培养的PHPH最适为最适为7.27.2一一7.47.4间，当间，当PHPH低于低于6.0 6

36、.0 或高于或高于7.67.6时，细胞的生长会受时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。但是，多数类到影响，甚至导致死亡。但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在偏碱性的情况下则会很快死亡。偏碱性的情况下则会很快死亡。 2005邓 宁 细胞的生长代谢自然离不开细胞的生长代谢自然离不开气体气体，容器，容器空间中的空间中的O O2 2及及COCO2 2足以保证细胞体内的代足以保证细胞体内的代谢活动的进行，但作为代谢产物的谢活动的进行，但作为代谢产物的COCO2 2在在培养环境中还有另外一个重要作用，即培养环境中还有另外一个重要作用，即调节调节PHPH的作用的

37、作用。 2005邓 宁 在在保证细胞渗透压保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种组成，如包括十几种及核酸代谢所需要的各种组成，如包括十几种必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。碳水化合物及无机盐类等。2005邓 宁培养的动物细胞的存活培养的动物细胞的存活渗渗 透透 压压水的质量水的质量营养条件营养条件气体条件气体条件温度条件温度条件条条 件件PH无菌条件无菌条件2005邓 宁四、设备和仪器四、设备和仪

38、器 1 1无菌实验室无菌实验室 2 2净化台净化台 3 3培养箱和培养箱和COCO2 2培养箱培养箱 4 4倒置显微镜倒置显微镜 5 5液氮罐液氮罐 6 6器材的清洗与消毒器材的清洗与消毒 7 7灭菌、消毒器具灭菌、消毒器具2005邓 宁 一、培养基选择与配制一、培养基选择与配制 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除需除需无菌、温度、空气、无菌、温度、空气、PHPH等条件以外，等条件以外，最主要的是培养基，它是最主要的是培养基，它是供给细胞营养供给细胞营养和和保正细胞生长的物质保正细胞生长的物质，也是细胞的生，也是细胞的生存存环境环境。培养基必须具有下述基本条

39、件：培养基必须具有下述基本条件：(1)(1)营养物质：营养物质： 培养基必须供给活细胞所需要的全部盐类培养基必须供给活细胞所需要的全部盐类(2)(2)缓冲能力：缓冲能力： 培养基必须含有非毒性的缓冲液，而且培养基必须含有非毒性的缓冲液，而且pHpH值在值在pH 7.0pH 7.07.27.2之间。之间。(3)(3)等渗性：等渗性： 溶解于培养基的物质浓度产生的等渗性必须与溶解于培养基的物质浓度产生的等渗性必须与细胞内的液体一致。细胞内的液体一致。 (4)(4)无菌：无菌： 培养基不能有微生物，利用培养基繁殖起来的培养基不能有微生物，利用培养基繁殖起来的微生物会破坏培养的活细胞。微生物会破坏培养

40、的活细胞。培养基的分类培养基的分类分类依据分类依据 种种 类类 状态状态 半固体培养基（软琼脂培养基）半固体培养基（软琼脂培养基） 液体培养基（最主要的类型）液体培养基（最主要的类型） 来源来源 合成培养基（市售粉末状）合成培养基（市售粉末状） 天然培养基（牛血清、鸡血浆等）天然培养基（牛血清、鸡血浆等） 平衡盐溶液平衡盐溶液 天然培养液天然培养液培养用液培养用液 合成培养液合成培养液 无血清培养液无血清培养液2005邓 宁常见培养基附加成分常见培养基附加成分：A.抗菌素抗菌素B.贴壁因子贴壁因子C.生长因子生长因子D.激素激素E.凝集素凝集素F.脂多糖脂多糖G.营养剂营养剂H.消化酶消化酶I

41、.生物缓冲剂生物缓冲剂J.染料染料K.动物血清动物血清L.常用培养基常用培养基M.无血清培养基无血清培养基2005邓 宁4 4、常用培养基类别、常用培养基类别a)a)平衡盐溶液平衡盐溶液（BSSBSS）b)b)天然培养基天然培养基c)c)合成培养基合成培养基d)d)无血清培养基无血清培养基2005邓 宁（a a）平衡盐溶液）平衡盐溶液（BSSBSS） BSS BSS又称生理盐水或盐溶液，具有维持渗透压、又称生理盐水或盐溶液，具有维持渗透压、控制酸碱度平衡的作用，同时供给细胞生存所控制酸碱度平衡的作用，同时供给细胞生存所得需能量和无机离子。其中盐是细胞生命所需得需能量和无机离子。其中盐是细胞生命

42、所需成份，而且在维持渗透压，缓冲和调节溶液的成份，而且在维持渗透压，缓冲和调节溶液的酸碱度方面起着重要的作用。酸碱度方面起着重要的作用。 2005邓 宁（b b）天然培养基）天然培养基 体液体液 组织提取液组织提取液 市售各种血清市售各种血清 水解乳蛋白水解乳蛋白 胶原胶原 鸡血浆，鸡胚浸出液鸡血浆，鸡胚浸出液 天然培养基包括天然培养基包括2005邓 宁(c)(c)合成培养基合成培养基 合成培养基有很多优点，人们用各种化学物合成培养基有很多优点，人们用各种化学物质设计出许多培养基。质设计出许多培养基。 合成培养基的主要成份有：合成培养基的主要成份有： 氨基酸、维生素、碳水化合物氨基酸、维生素、

43、碳水化合物 无机盐，其它辅助物质无机盐，其它辅助物质2005邓 宁(d)(d)无血清培养基无血清培养基 目前，大多数动物细胞的体外培养，目前，大多数动物细胞的体外培养，都不同程度地依赖血清等天然培养基。都不同程度地依赖血清等天然培养基。无血清培养基的研制是细胞工程中的无血清培养基的研制是细胞工程中的一个重要课题。一个重要课题。2005邓 宁二细胞培养技术的作用与内容二细胞培养技术的作用与内容细胞培养技术细胞培养技术细胞融合技术细胞融合技术细胞拆合细胞拆合染色体转移、染色体转移、DNADNA介导的基因转移介导的基因转移杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选细胞工程学细胞工程学基本方法基本方法2005邓 宁

44、 细胞培养技术及其发展和在科学领细胞培养技术及其发展和在科学领域中的应用，是以域中的应用，是以第一流的技术第一流的技术为基础为基础的，没有其它可接受的标准，有人说，的，没有其它可接受的标准，有人说，高深的理论知识本身不能产生良好的培高深的理论知识本身不能产生良好的培养技术。养技术。 细胞培养的细胞培养的目的目的为获得细胞产物，为获得细胞产物，在研究工作中有以下在研究工作中有以下长处长处：I.I.能长时间直接观察活细胞的形态结构和能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。生命活动。II.II.可以培养的细胞种类极为广泛。可以培养的细胞种类极为广泛。 2005邓 宁III.III.便于使用各种不

45、同的研究技术对细胞便于使用各种不同的研究技术对细胞进行研究。进行研究。IV.IV.易于附加物理、化学、生物、药物等易于附加物理、化学、生物、药物等实验因素。实验因素。V.V.能同时提供大量生物性状相似的实验能同时提供大量生物性状相似的实验材料。材料。2005邓 宁 但组织培养也确有但组织培养也确有不足之处不足之处，主要是组织或细胞，主要是组织或细胞离体后，独立生存在体外培养环境中，即使现在离体后，独立生存在体外培养环境中，即使现在模拟体内条件的技术已有很高发展，但与真实的模拟体内条件的技术已有很高发展，但与真实的体内条件相比，仍存在着一定的差异。当然，细体内条件相比，仍存在着一定的差异。当然，

46、细胞培养技术还在不断发展，很多培养技术日臻完胞培养技术还在不断发展，很多培养技术日臻完善，这种体内外的差异和分化的调控等问题将逐善，这种体内外的差异和分化的调控等问题将逐渐获得解决。渐获得解决。2005邓 宁 三工作方法与作风三工作方法与作风 是否只要掌握了培养技术，细胞生是否只要掌握了培养技术，细胞生长了，就算大功告成了？其它似乎无长了，就算大功告成了？其它似乎无关紧要呢？或者说细胞在体外就那么关紧要呢？或者说细胞在体外就那么容易地生长得好呢？容易地生长得好呢？2005邓 宁 实际上，不仅需要熟练掌握培养技术本实际上，不仅需要熟练掌握培养技术本身内容，还要有良好的工作作风和正确身内容，还要有

47、良好的工作作风和正确的工作方法，否则随时可出现如被污染的工作方法，否则随时可出现如被污染等的麻烦，甚至造成不可挽回的损失。等的麻烦，甚至造成不可挽回的损失。2005邓 宁培养用液专人负责配制，浓度准确，灭菌可靠。培养用液专人负责配制，浓度准确，灭菌可靠。一切培养用用品，都要有固定的存放地点一切培养用用品，都要有固定的存放地点, ,避免避免杂乱无章。杂乱无章。培养用品与非培养用品严格分开。培养用品与非培养用品严格分开。已消毒与未消毒的用品分别存在，保险期限已消毒与未消毒的用品分别存在，保险期限2-32-3天。天。2005邓 宁严格措施的目的：严格措施的目的：避免各种杂质混入细胞生存环境避免各种杂

48、质混入细胞生存环境防止微生物污染防止微生物污染防止不同细胞间的混杂防止不同细胞间的混杂2005邓 宁四细胞培养技术的种类四细胞培养技术的种类体外培养细胞的方式有两种，即原代培体外培养细胞的方式有两种，即原代培养和传代培养。养和传代培养。2005邓 宁细胞培养技术细胞培养技术 原代细胞培养技术原代细胞培养技术传代培养技术传代培养技术细胞大量培养技术细胞大量培养技术细胞克隆培养技术细胞克隆培养技术细胞冷冻和复苏技术细胞冷冻和复苏技术2005邓 宁 原代培养原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。较为严格地说是指成功传官后立即进行培养。较为严格地说是

49、指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，通常把第一代至第十代以内的培养细本性质，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为胞统称为原代细胞培养原代细胞培养。最常用的原代培养有。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养和分散细胞培养。原代培养原代培养2005邓 宁原代培养的含义原代培养的含义n1. 原代培养的实质就是原代培养的实质就是初次培养初次培养，培养，培养物不再分割，不换器皿物不再分割，不换器皿n2. 原代培养中的原代培养中的“代代”非细胞的非细胞的“代代”数数n3. 不分割培养物不等于不换培养液不分割培养物不等于不换培养

50、液n4. 植块培养不一定都是原代培养植块培养不一定都是原代培养2005邓 宁 原代组织块培养方法：原代组织块培养方法：n准备工作：准备工作：n1 1、 对所需器具、用品消毒对所需器具、用品消毒n2 2、 工作台面消毒工作台面消毒n3 3、 操作者本身的清洁处理和准备操作者本身的清洁处理和准备n4 4、 实验动物的消毒实验动物的消毒2005邓 宁取材及制备培养材料的步骤：取材及制备培养材料的步骤： 1 1、将从机体某部位取下的组织经无菌处理后、将从机体某部位取下的组织经无菌处理后先放入一个培养皿中用先放入一个培养皿中用HanksHanks液洗液洗3 3次次 2 2、然后用小剪刀剪成约、然后用小剪