荧光分析法-PPT课件.pptx

1、1v第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。色。3目录 荧光分析法的基本原理（一）、荧光产生（二）、荧光激发光谱与发射光谱（三）、荧光的产生与分子结构的关系（四）、影响荧光强度的外部因素（五）、荧光分光光度计及其使用（六）、荧光定量分析方法及实例（七）、荧光分析法的发展4几个概念 光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的

2、光外还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停止照射后，这种光线随之消失。这种现象称为光致发光。最常见的是荧光和磷光。荧光：物质分子接受光子能量激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法：基于对化合物的荧光光谱测量建立起来的分析方法。分类：分子荧光和原子荧光。根据激发光的波长范围可分为紫外-可见荧光；红外荧光和X射线荧光。1.1.分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程!在室温时，大多数分子处在在室温时，大多数分子处在电子基态的最低振动电子基态的最低振动能级能级，当受到一定的辐射能作用就会发生能级之，当受到一定的辐射能作用就会发生能级之间的跃迁。间的跃迁。!在基态

3、时在基态时, ,电子成对地填充在能量最低的各轨道。电子成对地填充在能量最低的各轨道。根据保利不相容原理根据保利不相容原理, ,一个给定轨道中的两个电一个给定轨道中的两个电子必定具有相反的自旋子必定具有相反的自旋, ,其自旋量子数其自旋量子数S S分别为分别为1/21/2和和 -1/2, -1/2, 其总的自旋量子数其总的自旋量子数S S总总=0=0!基态的多重性基态的多重性2S+1=1,2S+1=1,这种状态称为这种状态称为单重态单重态，以，以S S0 0表示表示（一）、荧光产生（一）、荧光产生5当基态电子激发到某高能级时当基态电子激发到某高能级时, , 将有两种激发态将有两种激发态：自旋相反

4、多重性为自旋相反多重性为1 1，称为，称为激发单重态激发单重态，用用S表示表示自旋平行多重性为自旋平行多重性为M=21+1=3，称为称为激发三重态激发三重态（triplet statetriplet state）用）用T T表示表示62.2.荧光的产生荧光的产生!平行自旋比相反自旋稳定平行自旋比相反自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；基态处于单重态；!基态基态( (S0)激发态激发态( (S1、S2激发态振动能级激发态振动能级) )：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定

5、频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；!激发态激发态基态：通过辐射跃迁和无辐射跃迁等基态：通过辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余的能量而返回至基态。方式释放多余的能量而返回至基态。!S0T1 禁阻跃迁禁阻跃迁；通过其他途径进入；进入；通过其他途径进入；进入的几率小。的几率小。7S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫83V0123V0123V012荧光的产生荧光的产生吸光吸光吸光吸光无辐射跃迁无辐射跃迁荧光荧光无辐射跃迁无辐射跃迁v激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基

6、态时，电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁通过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁10q 辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 l 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l 2 l 2 l 1 ； 磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1 S0跃迁）； 电子由S0

7、进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持续一段时间。11q 非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程v 振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间生振动弛豫的时间1010-12-12 s s。v 内部能量转换（内转换）：内部能量转换（内转换）：当两个电子激发态当两个电子激发态之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时，受激

8、分子常由高电子能级以无辐射方式转时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。移至低电子能级的过程。12v外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。v体系间跨越体系间跨越：处在激发态的电子发生自旋反转：处在激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。而使分子的多重性发生变化的过程。S S1 1的最低振动能级同的最低振动能级同T T1 1的最高振动能级重叠，的最高振动能级重叠，则有可能发生体系间跨越（则有可

9、能发生体系间跨越（S S1 1 T T1 1） 13（二）、荧光激发光谱与发射光谱（二）、荧光激发光谱与发射光谱1.1.荧光检测的基本原理荧光检测的基本原理142.2.荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱（激发光谱（excitation spectrum) )：固定测量波长，固定测量波长，将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射下所发射的荧光强度的变化，以下所发射的荧光强度的变化，以I IF F 激发激发作图，便作图，便可得到荧光物质的激发光谱。可得到荧光物质的激发光谱。发射光谱或荧光光谱（发射光谱或荧光光谱（fluoresc

10、ence spectrum) )：固固定激发光波长和强度定激发光波长和强度, , 让物质发射的荧光通过单色让物质发射的荧光通过单色分光分光, ,以测定不同波长的荧光强度以测定不同波长的荧光强度, , 以以I IF F荧光荧光作图作图，便可得到荧光物质的荧光光谱。，便可得到荧光物质的荧光光谱。15200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱16173.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系（1 1）. .斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shif

11、t)(Stokes shift) 荧光荧光发射波长总比激发光波长的现象，发射波长总比激发光波长的现象，振动弛豫和内转换振动弛豫和内转换消耗了能量。消耗了能量。（2）. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( (如能级如能级图图l l 2 ,l l 1)，产生不同吸收带，产生不同吸收带，但均回到但均回到第一激发单重态第一激发单重态的最的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如l l 2 )。 （3）. . 镜像规则镜像规则 通常荧

12、光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 1819镜像规则的解释镜像规则的解释S0 S2S0 S120（三）、荧光的产生与分子结构的关系（三）、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.荧光寿命和荧光效率荧光寿命和荧光效率（1）除去激发光源，分子荧光强度降低到激发时除去激发光源，分子荧光强度降低到激发时最大荧光强度的最大荧光强度的1/2所需的时间所需的时间，称为称为荧光寿命荧光寿命（2）荧光量子产率（荧光效率）荧光量子产率（荧光效率）。 荧光量子产率荧光量子产率（）： 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常

13、数有关荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；212.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）长共轭结构：长共轭结构：绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环；提高共轭度有利于增加荧光效率或杂环；提高共轭度有利于增加荧光效率（2）分子的刚性：分子的刚性：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。有很强的荧光，酚

14、酞却没有。（3）取代基效应取代基效应：芳环芳环上有供电子基，使荧光上有供电子基，使荧光增强；吸电子基则荧光增强；吸电子基则荧光减弱甚至熄灭。减弱甚至熄灭。两个必备条件：强紫外两个必备条件：强紫外-可见光吸收和一定荧光效率可见光吸收和一定荧光效率 吸收激发光的量子数发射荧光的量子数荧光效率233.3.荧光试剂荧光试剂!大部分化合物由于不吸收紫外光或荧光效率低大部分化合物由于不吸收紫外光或荧光效率低而不发生荧光或荧光很弱；而不发生荧光或荧光很弱；!为了提高荧光分析法的灵敏度、选择性，扩大为了提高荧光分析法的灵敏度、选择性，扩大荧光分析的范围，研究了一类试剂，它们一些荧光分析的范围，研究了一类试剂，

15、它们一些化合物反应能生成强荧光性产物；化合物反应能生成强荧光性产物；!常见的荧光试剂有：常见的荧光试剂有： 荧光胺荧光胺 能与脂肪胺或芳香胺生成强荧光物；能与脂肪胺或芳香胺生成强荧光物； 邻苯二甲醛（邻苯二甲醛（OPA） 能与能与 氨基酸等形成灵敏的氨基酸等形成灵敏的荧光产物荧光产物 测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂温度01溶剂02酸度03荧光熄灭剂04散射光05（四）、影响荧光强度的外部因素（四）、影响荧光强度的外部因素1. 1. 温度的影响温度的影响随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在0以下，每降以下，每降10荧光效率增加荧光效率增加3。

16、-80 时达到时达到100。原因是温度升高，分子运动速度加快，原因是温度升高，分子运动速度加快，碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因而降低了荧光；而降低了荧光；采用低温荧光测定技术，可大大提高灵敏度。采用低温荧光测定技术，可大大提高灵敏度。2. 2. 溶剂的影响溶剂的影响极性极性 溶剂极性增加，物质荧光强度增加，溶剂极性增加，物质荧光强度增加，波长红移；其原因是在极性溶剂中波长红移；其原因是在极性溶剂中* *的能的能量减小，机率增大；量减小，机率增大； 8-8-巯基喹啉在不同溶剂中的荧光波长和荧光效率巯基喹啉在不同溶剂中的荧光波长和荧光效率 介电常数介电常数 荧

17、光峰（荧光峰（nmnm）荧光效率荧光效率 乙腈乙腈 38.838.8 410 410 0.064 0.064 丙酮丙酮 21.521.5 405 405 0.055 0.055 氯仿氯仿 5.25.2 398 398 0.041 0.041四氯化碳四氯化碳 2.242.24 390 390 0.002 0.0023. 3. 溶液溶液pHpH的影响的影响 对弱酸或弱碱类荧光物质影响大，因为对弱酸或弱碱类荧光物质影响大，因为pHpH影响其离子或电子结构，从而影响荧光发生。影响其离子或电子结构，从而影响荧光发生。黏度黏度 荧光强度随溶剂黏度减少而降低，因荧光强度随溶剂黏度减少而降低，因为黏度降低分子

18、运动加快，碰撞使无辐射跃为黏度降低分子运动加快，碰撞使无辐射跃迁加大。迁加大。4. 4. 荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭荧光熄灭 荧光物质与溶剂或其他溶质作用荧光物质与溶剂或其他溶质作用引起荧光强度下降的现象；引起荧光强度下降的现象；荧光熄灭剂荧光熄灭剂(quenching medium) (quenching medium) 引起荧光引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子和硝基化合物是常见的熄灭剂。分子和硝基化合物是常见的熄灭剂。荧光熄灭法荧光熄灭法(fluorescence quenching (fluorescence quenching

19、method) method) 利用荧光强度与荧光熄灭剂的浓度利用荧光强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系来测定荧光熄灭剂含量的方法呈线性关系来测定荧光熄灭剂含量的方法5.5.散射光散射光散射光散射光 光子与分子碰撞，使光子的运动方光子与分子碰撞，使光子的运动方向改变而向不同角度散射；向改变而向不同角度散射；瑞利散射光瑞利散射光 光光子子与分子发生弹性碰撞时产生的与分子发生弹性碰撞时产生的散射光。由于弹性碰撞不发生能量交换，散射光。由于弹性碰撞不发生能量交换，瑞利散瑞利散射光射光的波长与入射光相同；的波长与入射光相同；拉曼拉曼散射散射光光 光子与分子发生非弹性碰撞时产生光子与分子发生非弹性碰撞时产

20、生的散射光。此时，光子与分子有能量交换，所以的散射光。此时，光子与分子有能量交换，所以拉曼光的波长比入射光稍长或稍短。拉曼光的波长比入射光稍长或稍短。常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长 激发光激发光 溶剂溶剂拉拉曼曼光波光波长长 波长波长 水水 乙醇乙醇 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 氯仿氯仿 248248 271 271267267 267 267 313313 350 350344344 344 344 320320 346 346 365 365 416 416 405 405 408 408 375375 410 410 405405 469

21、 469 459 459 458 458 418418 461 461 436 436 511 511 500 500 499 499 450450 502 502 四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。!影响荧光强度的主要因素影响荧光强度的主要因素 是是波长比入射光较波长比入射光较长的拉曼散射光。长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比因为物质发射的荧光波长比激发光（即入射光）波长长。激发光（即入射光）波长长。 消除溶剂拉曼光干扰的方法：消除溶剂拉曼光干扰的方法： - - 选择合

22、适的溶剂选择合适的溶剂- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动如硫酸奎宁的测定如硫酸奎宁的测定 （五）、荧光分光光度计及其使用（五）、荧光分光光度计及其使用1、荧光分光光度计1. 光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。2激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。3发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。4样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。

23、测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。5 检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。荧光分光光度计的结构示意图荧光分光光度计的结构示意图光源光源检测器检测器放大器放大器指示器指示器记录仪记录仪样品池样品池激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器!激发光谱的测定激发光谱的测定 扫描激发单色器（发射单扫描激发单色器（发射单色器固定在较长的波长）。色器固定在较长的波长）。 !荧光光谱的测定荧光光谱的测定 激发单色器固定在最大吸激发单色器固定在最大吸收波长，扫描发射单色器。收波长，扫描发射单色器。!定量分析条件的确定定量分析条件的确定 最大

24、激发波长和产生最大激发波长和产生的最大荧光波长（最灵敏的条件）。的最大荧光波长（最灵敏的条件）。溶液的荧光测定溶液的荧光测定2、荧光分析新技术!激光荧光分析激光荧光分析 以激光作为光源，大大提高分析以激光作为光源，大大提高分析的灵敏度和选择性；的灵敏度和选择性；!时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和监测之间的延缓时间不同分别检测；同，在激发和监测之间的延缓时间不同分别检测；!同步扫描荧光法同步扫描荧光法 发射单色器与激发单色器的波发射单色器与激发单色器的波长差保持固定，两者同时扫描，长差保持固定，两者同时扫描，得到宽度很窄的得到宽度很窄

25、的谱峰，可用于混合物定性分析；谱峰，可用于混合物定性分析；!胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析 利用表面活性剂在水中形成利用表面活性剂在水中形成的胶束对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用提高的胶束对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用提高分析的灵敏度和稳定性。分析的灵敏度和稳定性。（六）、荧光定量分析方法及实例（六）、荧光定量分析方法及实例1. 1. 荧光强度与物质浓度的关系荧光强度与物质浓度的关系 当溶液浓度很稀当溶液浓度很稀( (c L c L 0.05) 0.05)时，时， F F C C ；clIF03 . 2 F F - - 荧光强度，荧光强度， I I0 0 -入射光强度，入射光强度， - -

26、 摩尔吸光系数，摩尔吸光系数， C C - - 溶液浓度，溶液浓度， - - 荧光效率，荧光效率， L L - - 光程（液槽厚度）光程（液槽厚度）2. 2. 定量分析方法定量分析方法!荧光定量分析的基本方法与紫外类似；荧光定量分析的基本方法与紫外类似；!校正曲线法校正曲线法 测定已知浓度的标准溶液，绘测定已知浓度的标准溶液，绘制荧光强度浓度的工作曲线。制荧光强度浓度的工作曲线。 联立方程法联立方程法 利用荧光强度的加和性对多利用荧光强度的加和性对多组分混合物进行同时测定。组分混合物进行同时测定。xsxsCCFFFF00 比例法比例法3 3、荧光分析法的优点、荧光分析法的优点!1.灵敏度高。可

27、检测10-1010-12g/ml, !2.有机物分析选择性高。受激发光波长和荧光波长两个条件的制约。!3.应用范围广。不发生荧光的物质可通过适当的反应生成强荧光物质，然后分析。!4.方法快速简便，重现性好。!5.可用作HPLC的检测器，或与薄层、纸层等联用。4 4、荧光分析法的应用、荧光分析法的应用!(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析! 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。! 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；! 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、

28、钴、镍采用荧光熄灭法测定；! 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；! 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；! 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定!(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析! 见表见表 荧光分析法的应用荧光分析法的应用应用实例!维生素维生素B2的测定：的测定： 激发光波长：激发光波长：430440nm； 发射光波长：发射光波长：535nm。 pH67时荧光强度最大，时荧光强度最大，pH约约11时荧光消失。时荧光消失。 利血平片含量利血平

29、片含量的测定（中国药典）：的测定（中国药典）： 供试样品和对照品溶液加五氧化二钒试液，剧供试样品和对照品溶液加五氧化二钒试液，剧烈振摇后，烈振摇后，30放置放置1小时，在激发光波长小时，在激发光波长400nm；发射光波长；发射光波长500nm处读取荧光强度，处读取荧光强度，采用比例法计算含量采用比例法计算含量。（七）、荧光分析的发展（七）、荧光分析的发展!近十几年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电近十几年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，大大推动子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，大大推动了荧光分析

30、法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、了荧光分析法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和荧光光纤化学传感器等荧光分

31、析方面的某些新方法、新技术的发展，荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位和自动化的方向发展，析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学展，遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学和公安情报等诸多领域。和公安情报等诸多领域。