AKTA操作流程-ppt课件.ppt

1、汇报人部门部门抗体部抗体部20192019年年5 5月月3030日日AKTAAKTA操作流程操作流程Contents目录01020304硬件介绍软件介绍实验前后注意事项常用柱层析原理AKTA操作流程简易管路流向简易管路流向各模块标识各模块标识实物图实物图A1 A2 B1 B2管（最上的4瓶）B1、B2管B1、B2汇合(In B）一般装20%乙醇，保养用均有空气传感器，有气泡会自动关闭In B：B1 B2汇合 In A: A1 A2汇合1B管（从In B进泵后出来）1A 管 (从In B进泵后出来）可提供的最大流速为 150 ml/min 的最大装柱流速。系统压力检测器连接到系统泵上，连续测量系

2、统压力，并能够自动调整流速以避免达到设定的压力上限。A B管混合混合池所提供的标准混合器大小为 1.4 ml也可选择 0.6 ml 和 5 ml 混合器对于更高流速或难以混合的缓冲液需要更大的混合器AKTAAKTA操作流程操作流程样品环或 Superloop 的各种上样技术也可以使用选配的样品泵或系统泵直接把样品上样到层析柱上进样管（进样管（4）柱位阀（柱阀口上柱位阀（柱阀口上A A下下B B）检测吸收峰190-700nm 紫外/可见光紫外检测器紫外检测器苯环共轭双键系统,在紫外光区（220-300nm）显示特征的吸收谱带,最大光吸收分别为279、278、和259nm肽键的强吸收峰在214nm

3、处,214nm可测定多肽.280nm可测定含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的蛋白质分子.铁蛋白是一种多聚体储铁蛋白，由于在分子中心存在大量的铁离子，它在 340 nm显示出比其他蛋白更强的吸光值电导检测器用于监测缓冲液和样品的电导率，在线检测真实的梯度电导检测器整合温度传感器，可以校正由温度引起的电导率的变化电导检测器，电导检测器，pHpH计计在安装有pH电极的阀上直接注射校正液，可以轻松地进行 pH 计校正限流器连接在 pH 阀上，在管路中产生反压，防止在紫外流动池中形成气泡出口阀单出口控制阀 V9-Os 可以连接收集器并具有一个额外出口，可用于流穿组分的收集多出口收集阀V9-O

4、能够连接多个收集器，而且有 10 个出口可以进行大体积组分的收集收集器可以根据时间、体积或自动峰识别进行组分收集峰识别可以最大限度减少交叉污染，把不需要的组分直接排为废液组分收集器 F9-C 含有一个收集盘架，可以容纳从 3 到 50 ml 的各种试管以及 24、48 和 96 孔深孔板AKTAAKTA操作流程操作流程Unicorn6 4个窗口AKTA操作流程New 创建新用户给定权限数据注销及激活手动备份系统备份备份还原备份还原AKTA操作流程Run Data Run Data 模块模块Chromatogram Chromatogram 模块模块Flow scheme Flow scheme

5、 模块模块Run Log Run Log 模块模块AKTA操作流程AKTA操作流程积分区域限定峰参数调整积分处理窗口调整积分处理窗口可对峰命名可对峰命名AKTAAKTA操作流程操作流程实验前准备：系统管道水清洗实验前准备：系统管道水清洗实验前准备：缓冲液清洗实验前准备：缓冲液清洗实验前准备：实验前准备：pHpH校准校准实验前准备：收集器准备实验前准备：收集器准备放置对应盘架，齿轮条码对外放置对应盘架，齿轮条码对外实验前准备：水清洗、缓冲液润洗上样管道实验前准备：水清洗、缓冲液润洗上样管道实验前准备：接层析柱并设定相应参数实验前准备：接层析柱并设定相应参数实验后维护：管道去离子水泵洗实验后维护：

6、管道去离子水泵洗试验后准备：试验后准备：20%20%乙醇泵洗并保存乙醇泵洗并保存AKTAAKTA操作流程操作流程亲和层析示意图亲和层析示意图亲和层析凝胶过滤示意图凝胶过滤示意图凝胶过滤蛋白质电离示意图蛋白质电离示意图离子交换层析常见阳离子交换剂常见阳离子交换剂常见阴离子交换剂常见阴离子交换剂离子交换示意图离子交换示意图离子交换层析流程图离子交换层析流程图离子交换层析柱平衡及上样离子交换层析柱平衡及上样离子交换层析分步洗脱及清洗离子交换层析分步洗脱及清洗AKTA操作流程疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography） 利用固定载体上偶联的疏水性配基与流动相

7、中的疏水分子发生的可逆结合而进行分离的层析技术疏水作用（疏水作用（hydrophobic interaction)hydrophobic interaction) 非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集再一起的作用成为疏水作用疏水作用示意图疏水作用示意图水的溶解性取决于它能够与偶极子作用并能形成氢键水的溶解性取决于它能够与偶极子作用并能形成氢键疏水侧链包埋在蛋白质内部疏水侧链包埋在蛋白质内部溶菌酶示意图溶菌酶示意图亲水部分：深蓝及浅蓝色部分疏水部分：深红及浅红色部分疏水氨基酸大部分包含在蛋白质内部有些则暴露在外，形成疏水区域，这部分暴露在外的疏水性基团成

8、为疏水补丁蛋白质表面既有疏水区域也有亲水区域，在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用在某种高浓度的盐的存在下，它们可能由于增强的疏水相互作用而沉淀下来离子强度的改变，有机溶剂的存在，温度和pH（尤其在等电点，没有表面净电荷时）都能影响蛋白质结构和溶解度盐浓度逐步的降低，样品组分根据疏水性的依次洗脱层析柱料平衡及上样层析柱料平衡及上样分步洗脱及清洗分步洗脱及清洗AKTA操作流程反相色谱(reverse phase chromatography ，RPC) 利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。多肽与反相吸附剂之间互动的吸附多肽与反相吸附剂之间互动的吸附/ /解吸附模型解吸附模型柱料平衡及上样柱料平衡及上样分步洗脱及柱料清洗分步洗脱及柱料清洗AKTA操作流程分溶曲线与转移次数（n）的依赖关系