分子育种学课件分子标记与植物育种.ppt

1、本章主要内容本章主要内容（一）、遗传标记概述（一）、遗传标记概述 （二）、分子标记的类型及其基本原理（二）、分子标记的类型及其基本原理（三）、分子标记辅助选择（三）、分子标记辅助选择（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用 （五）、存在问题（五）、存在问题 1 1、概念、概念是指受基因控制的能够稳定遗传的，且是指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗传分析的某种特征。传分析的某种特征。多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受环境影响、操作经济、简单等（一）、遗传标记概述（

2、一）、遗传标记概述 2 2、遗传标记的类型、遗传标记的类型根据建立标记的对象可分为：根据建立标记的对象可分为：n形态学标记形态学标记 Morphological Marker n细胞学标记细胞学标记 Cytological Marker n生化标记生化标记 Biochemical Marker nDNADNA分子标记分子标记 DNA Molecular Marker * * 是生物特定的肉眼可见或简是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态特征。影响这单工具可测量的外部形态特征。影响这一特征的基因及其所在的染色体以及其一特征的基因及其所在的染色体以及其相邻基因在图谱上的位置都已明确相邻基因

3、在图谱上的位置都已明确。n孟德尔首先将形态标记作为遗传标记孟德尔首先将形态标记作为遗传标记- -分离规律和独立分配规律；长期以来植分离规律和独立分配规律；长期以来植物种质资源鉴定及育种材料选择一般都物种质资源鉴定及育种材料选择一般都是根据形态标记进行的。是根据形态标记进行的。（1 1）标记性状标记性状标记基因（括号内数字表示所在连锁群）标记基因（括号内数字表示所在连锁群）色素色素花色花色W1，w1（8）茸毛色茸毛色T，t（1）荚色荚色L1，l1（5）；）；L2，l2种皮种皮G，g（3）种脐种脐R，r-m（2）；）；I，i-i，I-k，i（7）双色双色K1；K2；K3子叶色子叶色D1（3）；）；

4、D2；Cyt-G，Y3叶叶小叶数目小叶数目L-f1，l-f2叶形叶形ln（4）；）；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2；落叶性落叶性A叶绿素缺失叶绿素缺失V1；y3；y4；y20茸毛类型茸毛类型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2）；）；P2，p2（4）；）；Pb，pb（14）；）；Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps茎茎扁化茎扁化茎f(11)节间长度节间长度S，s短叶柄短叶柄Lps，lps矮杆矮杆df2（6）；）；df3；df4；df5（1）大豆部分形态标记性状及标记基因大豆部分形态标记性状及标记基因简单简单直观直观数量少、多态性差数量少、多态性差易受环境条件因素

5、影响易受环境条件因素影响显隐关系要通过自交或杂交来检出显隐关系要通过自交或杂交来检出以染色体以染色体结构和数目为基础的标结构和数目为基础的标记。能够与特定的表型记。能够与特定的表型结合起来，从而确定控结合起来，从而确定控制某些性状的基因所在制某些性状的基因所在的染色体或染色体区段的染色体或染色体区段 连锁遗传和染色体学说连锁遗传和染色体学说（2 2）染色体染色体三体名称三体名称特征特征1三体三体1（草状）（草状）生长缓慢，高度不育，籽粒较细长且稍呈三角形，叶生长缓慢，高度不育，籽粒较细长且稍呈三角形，叶窄，与草相似窄，与草相似2三体三体2（矮生）（矮生）小穗短，护颖较长，自交高度不育，叶片短且

6、基部附小穗短，护颖较长，自交高度不育，叶片短且基部附近常扭曲近常扭曲3三体三体4（不育）（不育）植株最矮，叶片短厚呈革质，中脉凸出，穗伸出不完植株最矮，叶片短厚呈革质，中脉凸出，穗伸出不完全，自交完全不育全，自交完全不育4三体三体12（高秆）（高秆）植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常5三体三体5（叶片扭曲）（叶片扭曲）叶片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗着生紧密，叶片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗着生紧密，结实率高结实率高6三体三体3（有芒）（有芒）籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育7三体三体7（窄叶

7、）（窄叶）叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育8三体三体8（卷叶）（卷叶）叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育9三体三体9（粗壮）（粗壮）叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高10三体三体10（短粒）（短粒）叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常11三体三体11（拟正常）（拟正常）与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需细胞学鉴定与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需细胞学鉴定12三体三体6（丛生）（丛生）外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高

8、外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高核心技术是显微镜技术核心技术是显微镜技术核型分析核型分析把体细胞内染色体显微摄影后再把体细胞内染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统排列，显示染色体的特征排列，显示染色体的特征染色体分带技术染色体分带技术将所有染色体制片用不同将所有染色体制片用不同手段处理，再用不同染料染色，染色体显示手段处理，再用不同染料染色，染色体显示出不同的带数，如出不同的带数，如G带、带、C带、带、N带等，明确带等，明确鉴定许多物种中任一染色体鉴定许

9、多物种中任一染色体玉米染色体荧光核型玉米染色体荧光核型（9个探针）个探针）小麦小麦- -中间偃麦草附加系中间偃麦草附加系建立在生化遗传学基础上的特异性同建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。其编码基因的位置及其与其它基功酶或蛋白质。其编码基因的位置及其与其它基因位点的连锁关系也是明确的。因位点的连锁关系也是明确的。 蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其特征或特性特征或特性 主要利用种子蛋白：数量丰富、稳定、易于提取主要利用种子蛋白：数量丰富、稳定、易于提取

10、19411941年年Beadle W GBeadle W G等提出了等提出了“一个基因一个酶一个基因一个酶”的的假说，创立了生化遗传学。假说，创立了生化遗传学。5050年代许多科学家发现年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型的多种形式成为肉眼可辩的带型酶谱。酶谱。19591959年，年，MarkertMarkert等提出了用同工酶（等提出了用同工酶（isozymeisozyme）一）一词来描述具有同一底物专一性的

11、不同分子形式的酶，词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。2020世纪世纪60-7060-70年代出现了年代出现了在蛋白质水平反映生物遗在蛋白质水平反映生物遗传变异的同工酶标记。传变异的同工酶标记。同工酶同工酶基因基因染色体染色体酸性磷酸酶酸性磷酸酶Acp-112Acp-212Acp-37乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶Adh-111氨基肽酶氨基肽酶Amp-12Amp-28Amp-36Amp-48-淀粉酶淀粉酶-Amy-17过氧化氢酶过氧化氢酶Cat-16内肽酶内肽酶Enp-16酯酶酯酶Est-26Est-39Est

12、-51Est-77根据遗传物质根据遗传物质DNA本身的变异而本身的变异而建立的标记。确定建立的标记。确定DNA多态性与特定性状或多态性与特定性状或DNA片段的关系。片段的关系。 19801980年年BotsteinBotstein等首次提出了等首次提出了DNADNA限制片段长度多限制片段长度多态性态性(restriction fragment length polymorphism(restriction fragment length polymorphism，RFLP)RFLP)的概的概念，并指出念，并指出RFLPRFLP可作为遗传标记，从此开创了利用可作为遗传标记，从此开创了利用DNAD

13、NA多态性进行分子标记的新阶段。多态性进行分子标记的新阶段。 19851985年年MullisMullis发明了发明了PCR (DNAPCR (DNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应) )技技术，推动产生了许多以术，推动产生了许多以PCRPCR为基础新型的分子标记为基础新型的分子标记 随着随着DNADNA研究技术的不断发展，分子标记的类型越研究技术的不断发展，分子标记的类型越来越丰富，已广泛用于很多研究领域。来越丰富，已广泛用于很多研究领域。直接对直接对DNA进行标记，在植物体的各种组织、器进行标记，在植物体的各种组织、器官，不同发育时期均可检测到，不受环境、季节官，不同发育时期均可检测到，不受环

14、境、季节的限制，不存在表达与否的问题的限制，不存在表达与否的问题类型丰富，数量多，遍及整个基因组类型丰富，数量多，遍及整个基因组多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要创多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要创造特殊的材料造特殊的材料许多类型的分子标记表现位共显性，能够鉴别出许多类型的分子标记表现位共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁关系性状无必然的连锁关系可对控制任何目标性状的基因进行标记可对控制任何目标性状的基因进行标记（C

15、o-dominant marker）杂合体显示双亲的带型杂合体显示双亲的带型（Dominant marker）杂合体显示双亲之一的带型杂合体显示双亲之一的带型F MF F H H H H H F M M M M MF MF/H按核心技术分按核心技术分n以分子杂交为基础的的标记以分子杂交为基础的的标记n以以PCR为基础的标记为基础的标记n其它类型的分子标记（其它类型的分子标记（PCR和分子杂交结合、和分子杂交结合、测序）测序）按建立标记的按建立标记的DNA序列来源分序列来源分n以基因组以基因组DNA为基础的标记为基础的标记n以以EST为基础的标记为基础的标记2、常用分子标记技术简介、常用分子标记

16、技术简介 1）限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（R Restriction estriction F Fragment ragment L Length ength P Polymorphismolymorphism，RFLPRFLP） 原理：生物体在长期的自然选择和进化过程中，原理：生物体在长期的自然选择和进化过程中，由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成重排，会造成DNA在核苷酸序列上出现差异，在核苷酸序列上出现差异，从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用限制性内切酶来消化不同材料的限制

17、性内切酶来消化不同材料的DNA时，会产时，会产生数目和大小不同的生数目和大小不同的DNA片段，电泳后经转膜片段，电泳后经转膜和与探针杂交，就可以得到和与探针杂交，就可以得到DNA限制性片段长限制性片段长度多态性。度多态性。 1980年Botstein等首次提出RFLPRFLP标记的优点标记的优点 具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，能提供单个位点上较完整的资料；能提供单个位点上较完整的资料； 标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；在非等位在非等位RFLPRFLP标记之间不存在上位效应，因而互标记之间不存在

18、上位效应，因而互不干扰；不干扰； 标记源于基因组标记源于基因组DNADNA的自然变异，数量上几乎不的自然变异，数量上几乎不受限制受限制缺陷：缺陷：RFLPRFLP标记对标记对DNADNA需要量较大，操作繁琐，花需要量较大，操作繁琐，花费昂贵费昂贵其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于遗传连锁图的绘制和目标基因的标记遗传连锁图的绘制和目标基因的标记2）DNA指纹指纹（DNAFingerprinting，DF）实际上是实际上是RFLP的一种特殊类型。其的一种特殊类型。其基本原理与基本原理与RFLP是一致的，不同的是一致的，不同的是所用的探针，是所用的探

19、针，RFLP所用的探针是所用的探针是单拷贝或低拷贝，而单拷贝或低拷贝，而DF所用的探针所用的探针是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫星或人工合成的简单重复序列星或人工合成的简单重复序列。3）（Random andom A Amplified mplified P Polymorphism DNAolymorphism DNA，RAPD；RP-PCR；AP-PCR） 1990年年Williams和和Welsh以以一个一个人工合成的随随机的寡核苷人工合成的随随机的寡核苷酸序列酸序列(通常为通常为10个碱基个碱基)作引物作引物，以基因以基因组总组总DNA DNA 为模板，利用

20、为模板，利用PCRPCR技术随机扩增技术随机扩增基因组基因组DNADNA的不同位点，再经凝胶电泳分的不同位点，再经凝胶电泳分开，得到一系列多态性开，得到一系列多态性DNADNA片段。片段。 核苷酸置换造成引物与结合位点无法核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配匹配某个引物结合位点缺失某个引物结合位点缺失两引物结合位点间的间距过大，因片两引物结合位点间的间距过大，因片段太长致使扩增中断（段太长致使扩增中断（3kb)70bp）、小）、小卫星卫星（670bp）和微卫星和微卫星DNA(1-6bp)。 微卫星微卫星(Microsatellite,MS)是指基因组中以少数几个核是指基因组中以少数几个核苷酸苷

21、酸(多数为多数为24个个)为单位多次串联重复组成的长达为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列几十个核苷酸的序列，又称，又称简单序列重复简单序列重复(SimpleSequenceRepeats,SSR)或或短串联重复短串联重复(ShortTandemRepeats,STR)、或、或简单序列长度多态性简单序列长度多态性(SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP) 重复重复数目是可变的，重复序列数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的两侧都有物种特异性的保守序列保守序列，所以通过设计引物进行所以通过设计引物进行PCR扩增扩增，就可以就可以检测到不同的检测到

22、不同的DNA区域重复区域重复数目数目的多态性。的多态性。SSR(数目变异数目变异)旁邻或侧翼序列旁邻或侧翼序列(具有保守性具有保守性引物设计引物设计) 根据重复结构根据重复结构1）完全重复型）完全重复型(perfect),单一序列单元无中断单一序列单元无中断或无颠倒或无颠倒2）不完全重复型）不完全重复型(imperfect),单一序列单元有单一序列单元有中断或有颠倒；中断或有颠倒；3）混合型）混合型(compound)，不同序列混合、中断不同序列混合、中断 根据来源的序列根据来源的序列1）gSSR：来源于基因组序列：来源于基因组序列2）EST-SSR：来源于：来源于EST（表达序列标签）（表达

23、序列标签）aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctggggagggggtagcggcagcgctagtgaaagagaagaagaagaaggaggaggaggaggaggaggaagaggaggaagggaggcagaaggagcagatgaaagaagagaatatgaatatggatgtggatgtggtcatggaagaaggggacgacgacaacaagaagaacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacggggatgtaacaagtccgccgccggcggctgaggatgagaccaaggatggtggaaaggctaa

24、 agg-不完全重复不完全重复cga-完全重复完全重复-aggagatgagtctctctctctctctcgaagaagaagaagaagaatc混合型混合型在基因组中的分布更为随机，在基因组中的分布更为随机，不仅可以存在于内含子中，也可不仅可以存在于内含子中，也可以存在于编码区及染色体上的其它任一区域。以存在于编码区及染色体上的其它任一区域。不同物种基因组中的分布频率有所差异：不同物种基因组中的分布频率有所差异：大麦、番茄、水稻、大麦、番茄、水稻、马铃薯及拟南芥基因组马铃薯及拟南芥基因组DNADNA序列中分别为序列中分别为1/7.41/7.4、1/7.11/7.1、1/7.41/7.4、1

25、/6.41/6.4和和1/6.0kb ( Cardle1/6.0kb ( Cardle等，等，2000)2000)；人类基因组；人类基因组1/6 kb 1/6 kb ( Beckmann( Beckmann等等1992)1992)ESTEST中也广泛存在着中也广泛存在着SSRSSR：不同物种的不同物种的EST-SSREST-SSR分布频率存在很分布频率存在很大差异，大差异，1/3.4kb-1/20kb1/3.4kb-1/20kb；在单子叶和双子叶植物中在单子叶和双子叶植物中EST-SSR数量和分布也有差异数量和分布也有差异,平均分别为平均分别为1/64.6kb和和1/21.2kb不同不同EST

26、EST位置的位置的SSR SSR 含量与重复类型也各不相同含量与重复类型也各不相同: :编码区主要编码区主要是三核苷酸重复类型，是三核苷酸重复类型，33端非翻译区主要是三、四核苷酸重端非翻译区主要是三、四核苷酸重复类型，复类型，55端非翻译主要是二、三核苷酸重复类型端非翻译主要是二、三核苷酸重复类型几种植物中几种植物中EST-SSR的的分布频率和主导类型分布频率和主导类型 前提：知道重复序列两侧的前提：知道重复序列两侧的DNA序列序列传统的传统的SSR标记开发标记开发基因组基因组DNA提取提取限制性酶切或超声波处理限制性酶切或超声波处理分离小片段分离小片段DNA连接到载体连接到载体转化大肠杆菌

27、转化大肠杆菌构建基因组文库构建基因组文库合成合成SSR探针探针杂交筛选阳性克隆杂交筛选阳性克隆测序并设计引物测序并设计引物SSR-PCR及多态性分析及多态性分析传统的传统的SSR分子标记开发方法简单分子标记开发方法简单、易掌握易掌握这种方法在许多作物的这种方法在许多作物的SSR标记开发中被广泛标记开发中被广泛应用应用，现已获得的基因组现已获得的基因组SSR标记中标记中，四分之四分之三以上的是利用传统开发方法获得的三以上的是利用传统开发方法获得的但必须对每个克隆进行筛选鉴定但必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大工作量大，需花费大量人力，财力需花费大量人力，财力，而且效率较低而且效率较低，植物植物

28、中已报道的阳性克隆比率约为中已报道的阳性克隆比率约为2%3%，成成功获得引物的机率则更低。功获得引物的机率则更低。通过富集策略开发通过富集策略开发SSR标记标记为简化技术环节为简化技术环节，提高效率提高效率，降低开发成本，降低开发成本，通过研究建立了多种采取富积策略的通过研究建立了多种采取富积策略的SSRSSR标记开发方法标记开发方法 基于基于RAPD的开发策略的开发策略将将RAPD RAPD 随机引物与随机引物与SSRSSR连接，作为连接，作为PCRPCR扩增扩增引物或者将引物或者将RAPDRAPD扩增产物条带用扩增产物条带用SSRSSR探针探针进行进行SouthernSouthern杂交，

29、可以有效富集重复序杂交，可以有效富集重复序列。虽然目前尚不清楚列。虽然目前尚不清楚RAPDRAPD有利于有利于SSR SSR 富富集的机理集的机理, ,但这一发现大大激发了人们探但这一发现大大激发了人们探求富集求富集SSRSSR方法的兴趣。方法的兴趣。 PIMA(PCRIsolationofMicrosatelliteArrays)先用先用RAPD引物从基因组中获得随机扩增片引物从基因组中获得随机扩增片段段，扩增片段经载体克隆后扩增片段经载体克隆后，用特异用特异SSR及及载体引物对克隆阵列进行载体引物对克隆阵列进行PCR检测筛选含检测筛选含SSR克隆，对阳性克隆测序克隆，对阳性克隆测序根据以上

30、两种利用根据以上两种利用RAPD富集富集SSR的报道的报道，均避免了基因组文库的构建均避免了基因组文库的构建，有利于节省时有利于节省时间和人力、物力间和人力、物力，但基于此方法进行大量但基于此方法进行大量SSR分离的成功报道并不多分离的成功报道并不多。EST-EST-SSR标记的开发标记的开发 数量迅速增加的数量迅速增加的ESTsESTs为开发新的为开发新的SSRSSR标记提标记提供了宝贵的供了宝贵的资源资源，各种植物中约有，各种植物中约有5-10%5-10%的的ESTEST含有可用于建立标记的含有可用于建立标记的SSRSSR 建立建立EST-SSREST-SSR标记要标记要经济经济得多；而且

31、得多；而且EST-EST-SSRSSR标记来源于标记来源于DNADNA的转录区域，比的转录区域，比gSSRgSSR标标记具有更高的记具有更高的通用性；通用性；功能标记功能标记- -信息量高信息量高 开发开发EST-SSREST-SSR的基本过程：的基本过程：ESTEST序列的获取序列的获取与冗余与冗余ESTEST序列剔除；序列剔除；SSRSSR的搜寻；的搜寻；SSRSSR的信的信息统计与分析；息统计与分析；SSRSSR引物设计；引物设计；PCRPCR扩增及扩增及扩增产物电泳检测扩增产物电泳检测 ESTEST序列的获取与冗余序列的获取与冗余ESTEST序列剔除序列剔除公共数据库中已积累了大量的公

32、共数据库中已积累了大量的ESTEST序列，这些序列，这些序列是共享的，可免费下载（如序列是共享的，可免费下载（如www.ncbi. www.ncbi. nlm. nih.gov/ projects/dbESTnlm. nih.gov/ projects/dbEST ）采用采用ESTEST聚类分析软件，剔除冗余聚类分析软件，剔除冗余ESTESTSSRSSR的搜寻：的搜寻：利用软件利用软件RepeatMaskerRepeatMasker( (可直接可直接登录使用登录使用- -http:/repeatmasker.org/cgi-http:/repeatmasker.org/cgi-bin/WEBR

33、epeatMasker)bin/WEBRepeatMasker) 搜索非冗余搜索非冗余ESTEST中含中含有的有的SSRSSRSSRSSR的信息统计与分析：的信息统计与分析：明确明确SSRSSR特点特点SSRSSR引物设计：引物设计：Primer3Primer3（5 5）（http:/frodo. http:/frodo. wi.mit.edu /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiwi.mit.edu /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi） 4584条非冗余白菜EST中SSR的出现频率 重复类型重复类型基元种数基元种数SSR数目数目占全部

34、占全部SSR比例（比例（%）出 现 频 率出 现 频 率（%）单核苷酸单核苷酸2214.434.430.460.46二核苷酸二核苷酸420042.1942.194.364.36三核苷酸三核苷酸1019240.5140.514.194.19四核苷酸四核苷酸7132.742.740.280.28五核苷酸五核苷酸6173.593.590.370.37六核苷酸六核苷酸10234.854.850.500.50其它其它/81.691.690.170.17总计总计40474100.00100.0010.3410.34白菜白菜ESTEST中二核苷酸和三核苷酸重复基元中二核苷酸和三核苷酸重复基元 重复基元重复基

35、元 数量数量发生频率发生频率(%)所占比例所占比例(%)二核苷酸二核苷酸 GA/TCGA/TC1431433.123.1271.5071.50ATAT49491.071.0724.5024.50GT/ACGT/AC5 50.110.112.502.50GCGC3 30.070.071.501.50三核苷酸三核苷酸 GAA/TTCGAA/TTC72721.571.5737.5037.50TCC/AGGTCC/AGG38380.830.8319.7919.79CAT CAT 26260.570.5713.5413.54CCA/TGGCCA/TGG19190.410.419.909.90TTG/AA

36、CTTG/AAC16160.350.358.338.33CGG/CCGCGG/CCG9 90.200.204.694.69CGACGA5 50.110.112.602.60CTGCTG4 40.090.092.082.08TCTTCT2 20.040.041.041.04GATGAT1 10.020.020.520.52重复重复基元基元 长度长度(bp) 重复性质重复性质 变化范围变化范围 平均长度平均长度)完全重复完全重复 不完全重复不完全重复 总计总计 二核苷酸二核苷酸12-7927.411684200三核苷酸三核苷酸16-18355.288104192四核苷酸四核苷酸21-17671.8

37、8513五核苷酸五核苷酸26-15240.712517六核苷酸六核苷酸18-17482.732023合计合计12-18344.1227218445白菜白菜ESTEST中中SSRSSR的重复长度和性质的重复长度和性质引物编号引物编号重复基元重复基元预期产物大小预期产物大小Tm(Tm() )GC%GC%序列序列(5(5 3 3) )EST-EST-SSRP001SSRP001 （CTGCTG）2424 24459.8845.00AGCTCGTTGGTTCATTTGCTAGCTCGTTGGTTCATTTGCT 59.5255.00GCAACCACAGTTACAGCAGCGCAACCACAGTTACA

38、GCAGCEST-EST-SSRP002SSRP002 （TCTC）1717 21360.0850.00ACGATGAATCCAGTCAAGGCACGATGAATCCAGTCAAGGC 59.8345.00TAAAACCCTGTTCGTTTGGGTAAAACCCTGTTCGTTTGGGEST-EST-SSRP003SSRP003 （TCTC）1414 21260.0250.00TTTCTCCGCCAAGTAGTGCTTTTCTCCGCCAAGTAGTGCT 60.0750.00GACGGTTACGGAATCGAGAAGACGGTTACGGAATCGAGAAEST-EST-SSRP004SSRP

39、004 （CATCAT）7 7 19960.7245.00TGCTTGCAGAAAGACGAACATGCTTGCAGAAAGACGAACA 29359.8545.00TTGAGCGTAGGCAGGAAAATTTGAGCGTAGGCAGGAAAATEST-EST-SSRP005SSRP005 （CATACATA）1717 29360.6160.00CACGCCTAGCACTGTCTCCTCACGCCTAGCACTGTCTCCT 59.9355.00GGACTCGATGTAGGGGTTGAGGACTCGATGTAGGGGTTGAEST-EST-SSRP006SSRP006 （TTCTTC）2020

40、 24660.1960.00GGCTCCTCGGTTATAGCCTCGGCTCCTCGGTTATAGCCTC 59.9650.00ACCAGCTTCCATCCATAACGACCAGCTTCCATCCATAACGEST-EST-SSRP007SSRP007 （GAGA）3838 25159.8950.00TGGATTAAGACCATCCCGAGTGGATTAAGACCATCCCGAG 59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGAGAAGGAGCTCTTGTGAGCGEST-EST-SSRP008SSRP008 （GAGA）2222 22060.7355.00AGATTACTGG

41、AGAAGCCGCCAGATTACTGGAGAAGCCGCC 59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGAGAAGGAGCTCTTGTGAGCG对白菜对白菜EST-SSREST-SSR设计的引物（其中设计的引物（其中8 8对）对）扩增产物电泳检扩增产物电泳检测测 600500400300200tea planttea plantChinese cabbageChinese cabbageoilseed rapeoilseed rape SSR标记的特点标记的特点(1)数量较为丰富，覆盖整个染色体组数量较为丰富，覆盖整个染色体组(2)具有多等位基因特性，信息含量高具有多等位基因

42、特性，信息含量高(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性以孟德尔方式遗传，呈共显性(4)易于利用易于利用PCR技术分析，对技术分析，对DNA数量及数量及纯度要求不高，结果重复性好纯度要求不高，结果重复性好(5)每个位点由引物序列顺序决定，便于交换每个位点由引物序列顺序决定，便于交换6）ISSRISSR标记标记( (I Internter S Simple imple S Sequence equence R Repeatepeat，ISSRISSR ） ISSRISSR标记由加拿大标记由加拿大ZietkiewiczZietkiewicz等等(1994)(1994)所发展所发展 ISSRISSR原理：原

43、理：根据基因组内广泛存在的根据基因组内广泛存在的SSRSSR设计引物，设计引物，对两侧具有反向排列对两侧具有反向排列SSRSSR的一段的一段DNADNA序列进行扩增，序列进行扩增，然后进行电泳检测，根据谱带的有无及相对位置来然后进行电泳检测，根据谱带的有无及相对位置来分析多态性。分析多态性。(A)(B)SSR引物引物ISSRISSR引物引物 组成：组成：16-1816-18个碱基，由个碱基，由2-42-4个碱基组成的串联个碱基组成的串联重复序列和几个非重复的重复序列和几个非重复的1-41-4个锚定碱基组成个锚定碱基组成无锚定碱基引物可与无锚定碱基引物可与任何位置任何位置(TC)(TC)结合结合

44、5 5端加端加2 2个锚定碱基个锚定碱基（NNNN）引物只能与）引物只能与3 3端特异位置端特异位置(TC)(TC)结合结合3 3端加端加2 2个锚定碱基个锚定碱基（NNNN）引物只能与）引物只能与5 5端特异位置端特异位置(TC)(TC)结合结合引物中串联重复序列的选择：引物中串联重复序列的选择：基因组中出现最多的是基因组中出现最多的是二、三核苷酸二、三核苷酸SSRSSR，设计，设计ISSRISSR引物时应与这些序列引物时应与这些序列互补的加锚重复序列为主（互补的加锚重复序列为主（）引物中锚定碱基位置的确定：引物中锚定碱基位置的确定：根据用根据用100个个引物对小引物对小麦基因组进行扩增麦基

45、因组进行扩增，55个引物能扩增，产生多态个引物能扩增，产生多态性最多的是性最多的是CTCT、GAGA、CA CA 和和CCTCCT的引物，而且大多数的引物，而且大多数引物是在引物是在3 端加锚，只有引物端加锚，只有引物ATAT是在是在5 5 端加锚，端加锚，在在 3 3端加锚的端加锚的ATAT引物没有扩增产物引物没有扩增产物反应条件：反应条件：同普通同普通PCRPCR一样，也要对反应条件进行优一样，也要对反应条件进行优化，化，主要考虑引物浓度及其退火温度、镁离子浓度、主要考虑引物浓度及其退火温度、镁离子浓度、模板浓度。模板浓度。ISSRISSR扩增产物的分离：扩增产物的分离：常用琼脂糖浓度为常

46、用琼脂糖浓度为1.5-2.0%1.5-2.0%，聚丙烯酰胺浓度为聚丙烯酰胺浓度为6-8%6-8% 产物在进行测序胶电泳分离，具有单碱基的高产物在进行测序胶电泳分离，具有单碱基的高分辨率分辨率，遗传信息量大遗传信息量大 呈孟德尔式遗传呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性具有很好的稳定性和多态性 DNA 用量少用量少， 技术要求低技术要求低 引物具有通用性引物具有通用性 由于由于SSR 座位突变率高座位突变率高， 对变异反应非常敏感对变异反应非常敏感，所以易受到平行演化程度的影响所以易受到平行演化程度的影响，从而给物种从而给物种间亲缘关系的评估带来误差间亲缘关系的评估带来误差 针对每个座位测定

47、并找到针对每个座位测定并找到SSR 两端寡聚核苷酸两端寡聚核苷酸来设计引物来设计引物， 较费时耗力较费时耗力 通常为显性标记通常为显性标记，不能区分杂合体，不能区分杂合体7）( (S Single ingle N Nucleotide ucleotide P Polymorphismolymorphism，SNPSNP） SNPSNP是指基因组内是指基因组内单个核苷酸变异引起的单个核苷酸变异引起的DNADNA序列多序列多态性，包括单个碱基的转换态性，包括单个碱基的转换(transition(transition，如，如TCTC和和AG) AG) 以及颠换以及颠换(transversion)(t

48、ransversion)，而且其中最少一，而且其中最少一种等位基因在群体中的种等位基因在群体中的。 n转换的发生率总是明显较高：转换的发生率总是明显较高： 属属于转换型变异的于转换型变异的SNP约占全部约占全部SNP的的2/3。n在单个基因或整个基因组中在单个基因或整个基因组中SNP 的分布不均匀的分布不均匀，在非转录序列中，在非转录序列中要多于转录序列，而且在转录区要多于转录序列，而且在转录区也是非同义突变的频率比同义突也是非同义突变的频率比同义突变的频率低得多变的频率低得多 不同个体的不同个体的PCRPCR扩增片段直接测序是发现扩增片段直接测序是发现SNPSNP的最的最常用方法：常用方法：

49、利用目的性状相关的基因位点或利用目的性状相关的基因位点或EST EST 序列设序列设计引物，通过计引物，通过PCR PCR 扩增，对扩增，对PCR PCR 产物进行测序，然后应产物进行测序，然后应用用SNP SNP 发现的专业软件发现的专业软件GenalysGenalys或或DNAstarDNAstar，结合，结合ClustalClustal等软件，分析测序结果，排除测序错误，发现等软件，分析测序结果，排除测序错误，发现SNPSNP。 NasuNasu等等(2002)(2002)以水稻以水稻3 3个栽培种和个栽培种和1 1个野生种为实验材料，个野生种为实验材料，对分布于全基因组的对分布于全基因

50、组的417417个位点进行个位点进行SNPSNP研究，发现了研究，发现了2 2 800 800 个个SNPSNP，发生频率平均每，发生频率平均每89 bp 89 bp 有一个有一个SNPSNP。 TenaillonTenaillon等等(2001)(2001)以以2525个玉米近等系为材料，对分布在个玉米近等系为材料，对分布在1 1号染色体上的号染色体上的2121个遗传位点序列多样性进行了研究，发个遗传位点序列多样性进行了研究，发现平均每现平均每104 bp104 bp有一个有一个SNPSNP。 Kota(2001)Kota(2001)等等从从1900019000个个ESTEST中选择了目的性