膜片钳技术数据处理与分析-ppt课件.ppt

1、Clampfit 10膜片钳实验数据的处理与分析膜片钳实验数据的处理与分析膜片钳技术高级培训班膜片钳技术高级培训班2Patch clamp training classApr. 23-25, 20143Patch clamp training classApr. 23-25, 20144Patch clamp training classApr. 23-25, 2014一、基线的调零一、基线的调零l 基线的确认基线的确认 全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。 单通道开放时间较长 所记录的时间较短 同时开放的通道数目较多且长时间持续开放确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置

2、，反之亦然。如何确定：膜片两侧液体、钳制电位 单通道电流基线的确认单通道电流基线的确认如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置基线通道开放5Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 6Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基线不在零点的原因基线不在零点的原因 封接电阻的改变：漏电流 失调电位的存在：偏移、漂移 噪声的干扰：交流干扰 高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响7Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基线调零方法基线调零方法打开Anal

3、yze/Adjust/Baseline（1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移。（2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。（3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。（4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。8Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 坐标零点坐标零点Epoch A段（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtract slope of（去

4、除斜率法）9Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）Subtract fixed value（去除固定值法） （4）Adjust manually（手工调零法）10Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基线调零的注意事项基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数

5、据时就设法调整好基线。11Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示基线调零方法演示基线调零方法12Patch clamp training classApr. 23-25, 2014二、坏点的去除二、坏点的去除l 坏点产生的原因坏点产生的原因 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。 电容瞬变电流：电容的充放电反应。 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时） 手机来电：一过性高频。人手靠近记录探头：高幅、高频。13Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 坏点的

6、赋值坏点的赋值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值。 （2）Mean between cursor 1.2：Cursor 1-2之间均值。 （3）Mean between cursor 3.4：Cursor 3-4之间均值。 （4）Straight -line fit between cursor 1.2：Cursor 1-2之间的直线拟合值。 （5）Fixed value(pA/mV)：输入一个固定的数值。14Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示去除坏点演示去除坏点15Patch

7、clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除。（2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。16Patch clamp training classApr. 23-25, 2014三、滤波三、滤波l 信号采集前的滤波信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录：1-2 kHz 全细胞突触活动记录：10 kHz 单通道电流记录：10 kHz 动作电位记录：10 kHz17Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 信号采集后的滤波信号采集后的滤波 18Pat

8、ch clamp training classApr. 23-25, 2014 Lowpass Highpass Bandpass Notch Electrical Interference l Clampfit滤波类型滤波类型 19Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。 7种类型：（1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。（2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点（取决于Sm

9、oothing points，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。（4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。（5）RC ( single-pole)：用于时域数据。（6）8-pole Butterworth：用于频域数据。（7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。 20Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Lowpas

10、s滤波滤波21Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Highpass又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号而通过高频信号。 Clampfit提供两种：8-pole Bessel，单极RC 采用- f-3dB ，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。22Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Highpass滤波滤波23Patch clamp tr

11、aining classApr. 23-25, 2014l Bandpass相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。24Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Notch带阻滤波：削弱某一特定频率（如50 Hz交流）信号。中心频率（Center frequency）：10-3,000 Hz。频率宽度（3dB width）：频率宽度。-3dB width越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。25Pa

12、tch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Notch滤波滤波26Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Electrical Interference（EI）电干扰滤波器（Electrical interference filter, EI）为数码滤波器。可同时去除50 Hz及其谐波（100 Hz、150 Hz等）的复杂交流噪声。Harmonics from 1 to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1 kHz），一般去除第1-3个就够了。Cycles t

13、o average：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。Reference frequency：选50 Hz。27Patch clamp training classApr. 23-25, 2014EI所需最少数据点的计算举例所需最少数据点的计算举例滤波器所需最少数据点 （采样频率/ 50 Hz） Cycles to average若采样频率 10 kHz，则一个50 Hz正弦波周期的采样点数 10 kHz / 50 200 点若设定Cycles to average 10，则需要的最少采样点数 2,000点采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。28Patch clam

14、p training classApr. 23-25, 2014四、数据文件内部四、数据文件内部/ /之间的数学运算之间的数学运算l Analyze/Average Traces平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。要求： Clampex软件的Fixed-length events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式。 重复记录的信号，时程必须固定不变。29Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 降低信号噪声降低信号噪声信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行

15、。平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）：先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。然后再除以Trace条数N， 信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。30Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Average Traces功能功能31Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Segmented Average可对几个Trace中的某一相同时段（如Epoch A）或Cursor 1-2之间

16、的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。32Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Arithmetic对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。 如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的数值。33Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/ Average Files对几个文件

17、进行平均。例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。仅适用于Episodic Stimulation、High-speed oscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致。同样具有降低噪声的作用。34Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Average Files功能功能35Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/ Subtract Con

18、trol两个文件中所有相应的Trace进行相减，可用于去除漏电流或分离某种通道电流。要求两个文件要采用相同的Protocol来采集（信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率）。Test file为“大”文件“被减数”，Control File为“小”文件“减数”。 Multiply control traces by: 将Control File中的Trace乘以该倍数，然后再从Test file中减除。36Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Subtract Control功能功能37Patch clamp

19、 training classApr. 23-25, 2014l 注：注：如需要，可用Analyze/Data Reduction或Interpolation功能使采样频率变为一致。若Test file中的Signal或Sweep数少于Control file，后者多余的Signal或Sweep将不被使用。反之，若Test file中的Signal或Sweep数大于Control file，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。若Test file中的Sweep长度小于Control file，后者Sweep中多余的点将不被使用。反之，若Test file中的Sweep长度大于Co

20、ntrol file，后者Sweep中最后一个点将被反复使用。以Test file为准38Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Concatenate Files将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数连接后的文件会自动生成: Concatenate000-999.abf。39Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Concatenate Files功能功能40Patch clamp training

21、 classApr. 23-25, 201441Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l膜两侧电压差Vm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。 反映通道开启的速度速度及难易程度难易程度。一、离子通道的激活曲线一、离子通道的激活曲线42Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线： X轴脉冲电压Vm Y轴全细胞通道电导g/gmax Boltzmann方程拟合43Patch clamp training classApr. 23-25, 2014g：全细胞通

22、道激活电导gmax：全细胞通道最大激活电导Vm：不同的去极化（或超极化）脉冲电压V1/2：通道激活50%时的脉冲电压k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）lBoltzmann方程44Patch clamp training classApr. 23-25, 2014设：f(V) = gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0则即为前述的激活曲线方程：lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程45Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 先对数据进行处理（如

23、基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。 测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（pA）。 计算全细胞电导。gI / (VmVrev) 对全细胞电导g进行标化：g / gmax，gmax=Imax / (Vm-Vrev)。 作点图 最后用激活曲线方程对散点图进行拟合l 离子通道激活曲线制作步骤离子通道激活曲线制作步骤46Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示激活曲线的制作演示激活曲线的制作47Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 几点说明几点说明（1）通过激活曲

24、线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道开启过程的影响。（2）若要反映一类通道的激活特点或对不同组数据进行比较，需要有细胞例数上的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线。（3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确。48Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）： 反映通道：激活过程、阈电位、反转电位、整流特性l给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通道电流大小I，作I-V曲线： X轴Vm Y轴Il药物可影响通道激活

25、或衰减，使 I-V曲线形状发生改变。二、离子通道的二、离子通道的I-VI-V曲线曲线49Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Analyze/Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据。50Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示用用Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线51Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项（1）通道未开放时，电流应该为零。因

26、此要对基线进行细致的调零，可能要对每个Trace都进行基线调零。52Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中Edit Protocol的Run功能，也可用Analyze/Average Files功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流平均幅度值。53Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）测量同一种类多个细胞的I-V曲线，需要对电流幅度标化。原因：细胞大小不同，通道电流幅度不同。对于一个球形细胞，膜电容Cmd2 / 100 (pF) （d为细胞

27、直径(m)） 例子：若细胞直径d=20 m，其膜电容Cm=12 pF。电流密度：I/ Cm ，I/ Cm -V曲线Cm值的获得：（a）封接过程直接获得（b）Online Statistics窗口采集Cm ，最后获得平均Cm值I/Imax-V曲线。54Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位这个数据点。 Vhold = -60 mV55Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Analyze/Quick Graph/Trace v

28、s. Trace作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。56Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示用用Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲线曲线57Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项用注意事项用（1）Cursor 1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误。为了更好、更准确地放置Cursor，应该：（a）在采集时设计好Protocol。不好好58Patch clamp training cla

29、ssApr. 23-25, 2014（b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor。因为电流线滞后1电流线Waveform22159Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中。60Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活衰减（Decay） 衰减的指标：（1）时间常数；（2）10-90%衰减时间。三、离子通道的衰减三、离子通道的衰减CurrentWaveform61P

30、atch clamp training classApr. 23-25, 2014l衰减的时间常数衰减的时间常数通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数。Clampfit软件中“Exponential, standurd”指数拟合方程：衰减的时间常数i=2时，为双指数方程，拟合后获得1和2两个时间常数值。62Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示衰减的拟合衰减的拟合63Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 10-90%衰减时间衰减时间打开An

31、alyze/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Rise time, From 10 To 90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果。64Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放稳态失活（Steady-state inactivation）。用失活曲线反映。四、离子通道的失活曲线四、离子通道的失活曲线-90-80-70-60-500.00.20.40.60.81.01.22nA10m

32、s-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh= -90mV65Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据条件脉冲将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。测试脉冲检测未失活通道的电流大小。 X轴条件脉冲的电压数值 Y轴测试脉冲的电流大小 用Boltzmann方程拟合-90-80-70-60-500.00.20.40.60.81.01.22nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh= -90mV66P

33、atch clamp training classApr. 23-25, 2014I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流Vm：不同条件脉冲电压V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）lBoltzmann方程VmImax /2V1/20Imax67Patch clamp training classApr. 23-25, 2014lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程设：f(V) = IImax=1Vmid=V1/2V=VmV

34、c=kC=1则即为前述的失活曲线方程：68Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 失活曲线制作步骤失活曲线制作步骤（1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。（2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）。以测试脉冲的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax。（3）以Vm为x轴，I/Imax为y轴，作点图。（4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合。打开Clampfit中的Fit窗口，选择Boltzmann, charge-voltage方程。69Patch clamp training classApr

35、. 23-25, 2014l Clampfit演示失活曲线的制作演示失活曲线的制作70Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 几点说明几点说明（1）通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道失活过程的影响。（2）同通道激活曲线一样，若要比较不同组之间的差异，作失活曲线也需要有细胞例数（n）上的要求，要求出平均I/Imax值与标准差，再作失活曲线。（3）在作失活曲线时，脉冲电压的设定要注意：条件脉冲时间要设定得足够长，以使通道在某一去极化水平的失活达到完全，这需要根据通道的失活特点来设定。 Na+离子通道：衰减快，条件脉冲

36、20 ms宽 L型Ca 2+离子通道：衰减缓慢，条件脉冲的宽度十几秒条件脉冲与测试脉冲的间隔不能设定得过长，以防止失活的通道恢复，影响测试脉冲的测量。条件脉冲测试脉冲71Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 概念概念量效曲线：X轴药物剂量/浓度大小Y轴药理效应强弱阈浓度半效浓度EC50最大效能效价强度五、量效曲线五、量效曲线72Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/

37、通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I

38、，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。73Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）观察药物对某种受体/通道电流的阻断作用时：Imax：最大浓度药物作用后的电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半抑制浓度IC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imin。拟合时，设Imin=1。若药物对通道电流完全阻断，拟合后，Imax接近0。74Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）观察配体

39、诱发受体通道的电流时，因配体施加前通道不开放，可以采用Clampfit中的Hill, Langmuir方程对量效曲线进行拟合：设：i=1C=0C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数75Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例1. GABA诱发的诱发的GABA-A受体电流的量效曲线制作受体电流的量效曲线制作GABA : 0.5、1、5、10、50、100 mol/L76Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示GABA电流的量效曲线电流的量效曲线77Pa

40、tch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例2. 荷包牡丹碱荷包牡丹碱Bicuculline对对GABA-A受体电流抑制作用的量效曲线制作受体电流抑制作用的量效曲线制作Bicuculline:0, 0.1, 1, 10, 100 mol/LGABA : 10 mol/L78Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Bicuculline的量效曲线的量效曲线79Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 几点说明几点说明药物浓度的选择：（1

41、）要含有阈浓度和最大效能浓度。（2）按一定倍比关系：如1、2、5、10、20、50、100等。（3）至少4个浓度。80Patch clamp training classApr. 23-25, 2014药物施加原则：（1）按照从低到高浓度的顺序施加。在用浴槽灌流给药时要将前次药物冲洗掉，然后再给下一个浓度；在用培养皿时（难以灌流）每次施加的药量要少，防药物累加。（2）为获得稳定的量效曲线，药物从低到高的几个浓度最好在同一个细胞上施加。因此要求有合适的给药装置和高质稳定的全细胞记录。（3）正式实验前，需要先期做预实验来确定每个药物浓度的给药间隔时间，确保药物作用不受受体失敏的影响。81Patch

42、 clamp training classApr. 23-25, 2014依据实验要求和药物特点选择给药方法：（1）配体或通道的激动剂的施加要求快速、微量的给药装置；（2）昂贵的药物一般不采用灌流给药，而采用压力喷射给药；（3）受体拮抗剂可与配体一起施加，也可预先加入拮抗剂；（4）用培养皿时，因灌流置换液体困难，要采用压力喷射给药方法；（5）直接用加样枪向培养皿或浴槽内滴加药物的方法，只用于简单的药物定性；（6）离子电泳的给药方法适合于能够离子化的药物。82Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Clampfit的作图效果不理想，不适合正式发表文章。

43、采用作图软件Origin制作量效曲线：选择Analysis/Non-linear Curve Fit中的Logistic方程。83Patch clamp training classApr. 23-25, 2014实验一般要求有细胞的个数（n），获得平均值和标准差。 标准差可用作图软件Origin显示出来：在数据表窗口，选择Column/Set as Y Error。84Patch clamp training classApr. 23-25, 2014不同药物量效曲线的比较要求：选择相同的浓度兼顾阈浓度与最大效能浓度。将两个量效曲线作在一起的方法： Clampfit在制作第2个量效曲线时选择

44、Analyze/Append to Graph功能来制作。 Origin采用在数据表直接输入数据的方法将几条量效曲线作在一个图中。以某药物最大诱发电流来标化其他药物例子： Nic诱发最大电流=100% ACh诱发电流与之比较85Patch clamp training classApr. 23-25, 201486Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 单通道电导概念单通道电导概念单通道电导（G）指通道完全开放（Full opening）时，流经单通道的电流（i）与通道两侧电压差（钳制电位与通道反转电位的差值V）的比值，即：Gi /V电导的单位是

45、西门子（Siemens, S），一般通道电导多为pS级，少数通道电导较大，可达nS级（1 nS1 pA/mV）。一、单通道电导的测算一、单通道电导的测算i(pA)V(mV)87Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 亚开放状态（亚开放状态（Substate）不完全开放状态，电流幅度小。 NMDA受体：两个开放状态（50 pS主开放、40 pS亚开放） 人工纯化通道蛋白突变体：常有亚开放状态UnitarycurrentClosingDwell timeOpeningDwell timeSubstate *88Patch clamp training

46、 classApr. 23-25, 2014l闪烁现象（闪烁现象（Flicking）。通道的高速开放与关闭导致通道开放或关闭持续时间太短的现象。包括：（1）通道高速短时开放；（2）通道在开放时高速短时关闭。*89Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 单通道电导的测算方法单通道电导的测算方法（1）简单粗略的方法：找到基线，观测单通道电流幅度峰值，并除以膜片两侧的电压差与反转电位的差值，就得到单通道电导G。例：膜两侧电压差（钳制电位）Vm=30 mV反转电位Vrev=0 mV测得电流幅度i=100 pA则单通道电导G=100 pA/(30-0) m

47、V=3.33 nS该方法相对粗糙，但可快速观察电导的大致变化。90Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）斜率电导(Slope conductance)：通过单通道I-V曲线求得（见后）。91Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）直方图拟合法：拟合电流幅度分布，计算出单通道平均电导。 高斯（Gaussian）方程对单通道电流幅度直方图进行拟合。 Clampfit中的高斯方程：横轴x：电流幅度的bin值纵轴f(x)：检测的事件数目：单通道电流幅度的平均值：单通道电流幅度的标准差A、C：系数i1时

48、，一极高斯方程 G /V92Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示用演示用Histogram功能和高斯拟合测算单通道电导功能和高斯拟合测算单通道电导93Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项如果通道开放概率太低（只有很少的几个开放事件），则拟合会失真，此时需要延长采样记录时间以获得更多的开放事件。测算单通道电导时应选择单通道开放的峰值（Level 1的峰值）。亚开放状态多时，会在单通道电流幅度峰值与基线峰值之间形成亚开放状态的峰值，据此可测算出亚开放电导。闪烁

49、现象多会使单通道电流幅度曲线峰值的左右不对称，影响电导的测算。升高检测事件的阈值或限制事件持续时间，可去除闪烁现象。如果记录的数据中都是闪烁现象，没有完全开放事件，则无法测算电导。在人工质膜实验中，这种情况多表明通道蛋白纯化过程有问题。无论上述哪种方法，都需要先确定正确的基线，并对膜片漏电流进行去除，同时还要有一定的例数（膜片数）要求。94Patch clamp training classApr. 23-25, 2014二、单通道开放概率的分析二、单通道开放概率的分析分析开放概率之前，要先对开放事件进行检测。l 单通道事件的检测单通道事件的检测（1）事件检测前的准备工作 基线调零、坏点去除、

50、滤波等。（2）对检测参数进行设定（右图）（3）进行事件检测95Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示单通道开放事件的检测演示单通道开放事件的检测96Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 单通道开放概率分析实例单通道开放概率分析实例以机械敏感性MscL通道为例，单通道开放概率Po的计算过程如下：（1）打开单通道数据文件，进行数据处理（2）进行事件检测（3）计算Po（4）作压力-单通道开放概率关系曲线（5）对压力-单通道开放概率关系曲线进行拟合Major TitlePressur