生物技术制药-ppt课件.ppt

1、医学资源1生物技术制药医学资源2一、课程内容一、课程内容第一章第一章 绪论绪论第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第三章第三章 动物细胞工程制药动物细胞工程制药第四章第四章 抗体制药抗体制药第五章第五章 植物细胞工程制药植物细胞工程制药第六章第六章 酶工程制药酶工程制药第七章第七章 发酵工程制药发酵工程制药 医学资源3Chapter 1 绪绪 论论医学资源4第一节 生物技术的发展史一、生物技术（一、生物技术（biotechnology）生物技术生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有组织、细胞及其组分）

2、的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。商品和服务的一个综合性的技术体系。 包括包括 基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。医学资源5 不可取代性（育种、制药）不可取代性（育种、制

3、药） 快速、精确（单克隆抗体检测妊娠）快速、精确（单克隆抗体检测妊娠） 低耗、高效（生物酶催化：化学催化）低耗、高效（生物酶催化：化学催化） 副产物少、副作用小、安全性好副产物少、副作用小、安全性好 高附加值性高附加值性 符合生态型的经济技术发展体系符合生态型的经济技术发展体系生物技术的优越性生物技术的优越性医学资源6现代生物技术的基础学科和分支分子生物学分子生物学 微生物学微生物学生物化学生物化学遗传学遗传学细胞生物学细胞生物学化学工程化学工程现现代代生生物物技技术术医药生物技术医药生物技术生物技术疫生物技术疫苗苗生物技术诊生物技术诊断断农业生物技术农业生物技术家畜生物技术家畜生物技术海洋生

4、物技术海洋生物技术医学资源7二、生物技术发展简史传统生物技术的技术特征是传统生物技术的技术特征是酿造技术酿造技术公元前公元前60006000年古代巴比伦人酿造啤酒年古代巴比伦人酿造啤酒公元前公元前40004000年埃及人发酵面包年埃及人发酵面包我国我国 殷朝殷朝 制酱制酱周朝周朝 制醋制醋特点特点: :自然发酵、全凭经验自然发酵、全凭经验传统生物技术阶段传统生物技术阶段医学资源8近代生物技术的技术特征是近代生物技术的技术特征是微生物发酵技术微生物发酵技术16741674年荷兰布商列文虎克自制了高倍显微镜年荷兰布商列文虎克自制了高倍显微镜(300(300倍左右倍左右) )观察到了微生物。观察到了

5、微生物。18651865年法国科学家巴斯德证明了发酵原理。年法国科学家巴斯德证明了发酵原理。19281928年英国年英国 FlemingFleming发现青霉素发现青霉素19401940年英国弗洛里、钱恩分离出青霉素年英国弗洛里、钱恩分离出青霉素近代生物技术阶段近代生物技术阶段医学资源9近代生物技术时期的特点：近代生物技术时期的特点：1. 1. 产品类型多产品类型多 初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体）物转化（甾体） 等等；2. 2. 生物技术要求高生物技术要求高（纯种、无菌、通气、产品质量要求也高）（纯种、无菌、通气、产品

6、质量要求也高）；3. 3. 生产设备规模巨大生产设备规模巨大 500500立方米，立方米，20002000立方米立方米 ；4. 4. 技术发展速度快。技术发展速度快。 青霉素初期发酵效价为青霉素初期发酵效价为200 U/ml,200 U/ml,现在为现在为80000 U/ml80000 U/ml。医学资源10现代生物技术的技术特征就是以现代生物技术的技术特征就是以基因工程基因工程为首要标为首要标志志19531953年年 Watson Watson 、CrickCrick提出提出DNADNA双螺旋结构双螺旋结构19731973年年 建立建立DNADNA重组技术（重组技术（Boyer&CohenB

7、oyer&Cohen，美国），美国）19751975年年 建立单克隆抗体技术（杂交瘤细胞）建立单克隆抗体技术（杂交瘤细胞）19781978年年 大肠杆菌表达出胰岛素大肠杆菌表达出胰岛素19971997年年 英国克隆多利羊英国克隆多利羊现代生物技术现代生物技术医学资源11现代生物技术包括现代生物技术包括: : 重组重组DNADNA技术技术 细胞和原生质体融合技术细胞和原生质体融合技术 酶和细胞的固定化技术酶和细胞的固定化技术 植物脱毒和快速繁殖技术植物脱毒和快速繁殖技术 动物和植物细胞的大量培养技术动物和植物细胞的大量培养技术 动物胚胎工程技术动物胚胎工程技术医学资源12 现代生物反应工程和分离

8、工程技术现代生物反应工程和分离工程技术 蛋白质工程技术蛋白质工程技术 海洋生物技术海洋生物技术 现代微生物发酵技术现代微生物发酵技术医学资源13 不能忘记的人不能忘记的人J D Watson F H C Crick19531953年年4 4月月2525日，英国日，英国自然自然杂志发表了杂志发表了沃森和克立克的文章沃森和克立克的文章“核酸的分子结构核酸的分子结构 DNADNA的一个结构模型的一个结构模型”。标志着标志着DNADNA双螺旋结构双螺旋结构的建立，从此，遗传的建立，从此，遗传学和生物学的历史从学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子细胞阶段进入了分子阶段。阶段。医学资源14 不能忘记的人不

9、能忘记的人F Sanger W Gilbert Sanger （英国化学家）（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基最早测定胰岛素的氨基酸顺序酸顺序获得获得19581958年诺贝年诺贝尔化奖。尔化奖。2222年后，他因年后，他因测定了测定了一种噬菌体的一一种噬菌体的一级结构级结构获获19801980年的诺贝年的诺贝尔化学奖。尔化学奖。 Gilbert 在在DNADNA测序测序领域，因其卓越的工作领域，因其卓越的工作获得获得19801980年诺贝尔化学年诺贝尔化学奖。奖。医学资源15 不能忘记的人 Paul Berg Berg （美国生物化学（美国生物化学家）通过把两个不同来家）通过把两个不同来源的源

10、的DNADNA连结在一起并发连结在一起并发挥其应有的生物学功能，挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作对基因进行操作。他作为为“重组重组DNADNA技术之父技术之父”于于19801980年获诺贝尔化奖。年获诺贝尔化奖。医学资源16 不能忘记的人Kary B Mullis19851985年穆利斯发明了年穆利斯发明了高高效复制效复制DNADNA片段的聚和酶片段的聚和酶链式反应（链式反应（PCRPCR）技术）技术，利用该技术可从极其微利用该技术可从极其微量的样品中大量生产量的样品中大量生产DNADNA分子，使基因工程获得分子，使基因工程获得了革命性发展。了

11、革命性发展。医学资源17第二节第二节 生物技术药物生物技术药物生物技术制药：生物技术制药：生物技术药物：生物技术药物： 生物药物：生物药物：采用现代生物技术，按照人的设采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来生产所想，借助动植物微生物来生产所需的医药品。需的医药品。一般来说一般来说, ,采用采用DNADNA重组技术或其重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。酸类药物。生物技术药物、生化药物、微生物生物技术药物、生化药物、微生物药物、海洋药物、生物制品的统称。药物、海洋药物、生物制品的统称。医学资源18生物技术药物分类重组蛋白质药物重组蛋白质药物治

12、疗性抗体药物治疗性抗体药物核酸药物核酸药物干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激因子等因子等PanorexPanorex单抗用于结肠直肠炎治疗单抗用于结肠直肠炎治疗ZenapaxZenapax用于治疗急性肾移植排斥反应用于治疗急性肾移植排斥反应反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸、裸核苷酸、裸DNADNA疫苗与基因药物疫苗与基因药物医学资源19生物技术药物的特性1.1.分子结构复杂分子结构复杂2.2.具有种属特异性具有种属特异性3.3.治疗针对性强、疗效高治疗针对性强、疗效高4.4.稳定性差稳定性差5.5.基因稳定性基因稳定性

13、6.6.免疫原性免疫原性7.7.体内的半衰期短体内的半衰期短8.8.受体效应受体效应9.9.多效性和网络性效应多效性和网络性效应10.10.检验的特殊性检验的特殊性医学资源20第三节 生物技术制药一、生物技术制药的特征一、生物技术制药的特征 高技术高技术 高知识层次的人才和高新的技术手段高知识层次的人才和高新的技术手段 高投入高投入 一个新的生物医药的平均费用为一个新的生物医药的平均费用为1 13 3亿美元，有的高达亿美元，有的高达6 6亿。亿。 高风险高风险 成功率为成功率为5%5%10%10%，研制时间却需，研制时间却需8 81010年。年。 高收益高收益 利润率回报可高达利润率回报可高达

14、1010倍倍, ,上市后上市后2 23 3便可收回投资。便可收回投资。医学资源21二、生物技术在制药中的应用1.1.基因工程制药基因工程制药（1 1）基因工程药物品种的开发）基因工程药物品种的开发 生长激素抑制素生长激素抑制素 1 mg 1 mg 传统法：传统法：1010万只羊的下丘脑，现：万只羊的下丘脑，现：10 L10 L大肠大肠杆菌培养液，杆菌培养液，0.30.3美元美元/mg/mg（2 2）基因工程疫苗）基因工程疫苗（3 3）基因工程抗体）基因工程抗体（4 4）基因诊断与基因治疗）基因诊断与基因治疗医学资源22（5 5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型）应用基因工程技术建立新药的筛选

15、模型（6 6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物物药物（7 7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用 将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌种对缺氧环境的耐受力。将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌种对缺氧环境的耐受力。（8 8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物 人体蛋白人体蛋白AAT 10AAT 10万美元万美元/g/g，转基因羊羊奶中，转基因羊羊奶中20 g/L20 g/L医学资源232.2.细胞工程制药细胞工程制药（1 1）单克隆抗体技术）单克隆抗体技术（2 2）动

16、物细胞培养）动物细胞培养（3 3）植物细胞培养生产次生代谢产物）植物细胞培养生产次生代谢产物3.3.酶工程制药酶工程制药4.4.发酵工程制药发酵工程制药工艺改进、新药研制和菌种改造工艺改进、新药研制和菌种改造医学资源24三、我国生物技术制药现状和发展前景开始于开始于2020世纪世纪7070年代初，先是进行年代初，先是进行固定化酶固定化酶的研究，以后的研究，以后固定化酶和固固定化酶和固定化细胞定化细胞的研究与应用得到发展。的研究与应用得到发展。7070年代后期，开始年代后期，开始跟踪国外基因工程技术跟踪国外基因工程技术的某些基础性工作。的某些基础性工作。8080年代初期，开始年代初期，开始乙型肝

17、炎基因工程疫苗乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素基因工程干扰素的研究，生的研究，生物技术方面的项目得到了国家的支持，其中物技术方面的项目得到了国家的支持，其中 -1b-1b型干扰素型干扰素为我国首创。为我国首创。医学资源25目前我国生物制药技术申报貌似目前我国生物制药技术申报貌似“活跃活跃”，实际上都是在，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。与发达国家相比，我国与发达国家相比，我国生物技术实验室技术生物技术实验室技术差距不大，但差距不大，但在在产业化方面产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有与世界的差

18、距正在逐渐加大：当今世界有2020多多种畅销生物药时，我国能生产种畅销生物药时，我国能生产1010种；而现在世界上有种；而现在世界上有140140多多种时，我国却只能生产种时，我国却只能生产2020多种多种 。由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，业，产业规模较小产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条；而一些传统型

19、的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。件等影响而难以迅速进入生物制药领域。医学资源26医药生物技术发展展望 2121世纪是医药生物技术快速发展的时期世纪是医药生物技术快速发展的时期, , 生物制药、化学药物、中药形生物制药、化学药物、中药形成三足鼎立成三足鼎立, ,有效的为人类健康服务。有效的为人类健康服务。 1.1.利用新发现的人类基因开发新型药物。利用新发现的人类基因开发新型药物。 人类基因组计划已完成。人类基因组计划已完成。19861986年美国科学家达尔贝科提出的人类基因组计划，年美国科学家达尔贝科提出的人类基因组计划，19901990年启动该计划。年启动该计划。2

20、323对染色体对染色体3030亿对碱基，亿对碱基，3.53.5万个基因进行测序。万个基因进行测序。美国承担美国承担54%54%，英，英33%33%，日，日7%7%，法，法2.8%,2.8%,德德2.2%,2.2%,中国中国1%1%。19991999年中国加入人类基因组计划，投资年中国加入人类基因组计划，投资3 3亿元，负责测定亿元，负责测定3 3号染色体号染色体30003000万对万对碱基，碱基，20002000年年4 4月完成。月完成。医学资源272.2.新型疫苗的研制新型疫苗的研制 艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。 3.3.基因工程活性肽的生产基因工程活性肽的生产

21、基因药物基因药物: :淋巴因子、生长因子、激素和酶淋巴因子、生长因子、激素和酶 4.4.其它医药业将得到不断改造和发展其它医药业将得到不断改造和发展 转基因药材（利用转基因的烟草来生产人造血转基因药材（利用转基因的烟草来生产人造血浆将成为现实）浆将成为现实）医学资源285.新型生物反应器和新型生物技术不断出现 新型生物反应器有新型生物反应器有: : 气升式生物反应器气升式生物反应器 流化床式生物反应器流化床式生物反应器 固定床式生物反应器固定床式生物反应器 袋式或膜式生物反应器袋式或膜式生物反应器 中空纤维生物反应器等中空纤维生物反应器等。医学资源29四、我国的医药生物技术 已上市的基因工程药

22、物和疫苗已上市的基因工程药物和疫苗 19951995年年 白细胞介素白细胞介素-2-2 1996 1996年年 1b-1b-干扰素干扰素2a-2a-干扰素干扰素 2b-2b-干扰素干扰素 19971997年年 粒细胞集落因子粒细胞集落因子 红细胞生成素红细胞生成素 19921992年年 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗医学资源30作业：作业：1 1、生物技术制药的概念。、生物技术制药的概念。2 2、生物技术药物分为哪些类型？、生物技术药物分为哪些类型？3 3、生物技术制药有哪些特征？、生物技术制药有哪些特征？医学资源31医学资源32Chapter 2 基因工程制药基因工程制药医学资源33用途：用途：主

23、要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。获取方式：获取方式：生化提取生化提取 基因工程表达基因工程表达 成本高产量低成本高产量低质量难以保证质量难以保证成本低产量高成本低产量高活性强性质优活性强性质优实例：实例：人生长激素（侏儒症）人生长激素（侏儒症）50 具新鲜尸体具新鲜尸体脑下垂体中提取脑下垂体中提取采用基因工程从采用基因工程从 12 升细升细菌培养液中提取获得菌培养液中提取获得= =医学资源341982 1982 年世界上第一个基因工程药物年世界上第一个基因工程药

24、物 重组人胰岛素获准生重组人胰岛素获准生产销售，至今已有产销售，至今已有 100 100 多个生物技术药物上市多个生物技术药物上市; ;促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）以全球销售额）以全球销售额 38 38 亿美元的业绩，居亿美元的业绩，居全球最畅销全球最畅销 10 10 种药物的第种药物的第6 6名；名；美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜首首, ,其其 2002 2002 年产值和销售额已超过年产值和销售额已超过 200 200 亿美元亿美元; ;1989 1989 年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程

25、药物年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物 - - 重重组人干扰素（组人干扰素（IFNIFN1b1b）上市以来，目前，世界上销售额排前）上市以来，目前，世界上销售额排前 10 10 位的生物技术药物我国已能生产位的生物技术药物我国已能生产 8 8 种。种。国际生物医药产业发展动态国际生物医药产业发展动态医学资源35第一节 概 述生物技术的核心就是基因工程，生物技术的核心就是基因工程，2020世纪世纪7070年代基因年代基因工程诞生工程诞生, ,最先应用在医药科学领域。最先应用在医药科学领域。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此

26、外在制备过程可能受到的病毒、衣原素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。 （如：生长激素抑制素（如：生长激素抑制素 1 mg 1 mg 传统法：传统法：1010万只羊的下丘脑，现：万只羊的下丘脑，现：10 L10 L大肠杆菌大肠杆菌培养液，培养液，0.30.3美元美元/mg/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。医学资源36应用基因工程技术可十分方便且有效地解

27、决传统应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。改进，且可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。技术获得。医学资源37利用基因工程技术生产药品的优点：（1 1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临

28、床使用提供有效的保障；供有效的保障；（2 2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；应用范围；（3 3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；生理活性物质；医学资源38（4 4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素去除。如白细胞

29、介素-2-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素氨酸，白细胞介素-2-2的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；（5 5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。物筛选来源。利用基因工程技术生产药品的优点：医学资源39第二节 基因工程药物生产的过程 基因工程技术基因工程技术是将所要重组对象的是将所要重组对象的目的基因目的基因插入插入载体、拼接、转入新的载体、拼接、转入新的宿主细胞宿主细胞，构建成工程菌，构建成工程菌( (或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使

30、目的基因在工程菌的基因在工程菌( (或细胞），内进行复制和表达或细胞），内进行复制和表达的技术。的技术。医学资源40基因工程药物生产的上游和下游上游阶段：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游阶段：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。医学资源41获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程医学资源42基因工程基本过程切接转增检医学资源43工

31、程菌（或细胞）构建中重要的工具工具工具：酶：酶限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶逆转录酶逆转录酶Klenow Klenow 酶大片段（酶大片段（DNADNA聚合酶聚合酶 I I）核酸酶核酸酶S1S1医学资源44第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？）成法。（不能直接分离？） 一、逆转录法一、逆转录法逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的就是先分离纯化目的基因的mRNAmRNA，再，再反转录成反转录成 cDNAcDNA，然后进行，然后进行 cDNA cDNA 的克隆表达。的克隆表达。cDNAcDNA与模板与模

32、板mRNAmRNA序列严格互补，而不含内含子。序列严格互补，而不含内含子。医学资源45逆转录法的步骤逆转录法的步骤 1 1、mRNAmRNA的纯化的纯化 2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成 3 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成 4 4、cDNAcDNA克隆克隆 5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞 6 6、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定 7 7、目的、目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定医学资源46cDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S1医学资源471、mRN

33、A的纯化真核细胞真核细胞 mRNA 3-polyA mRNA 3-polyA （2020250)250)采用采用Oligo dT-Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将纤维素，以亲和层析法将mRNAmRNA从细胞从细胞总总RNARNA中分离出来。中分离出来。2、cDNA第一链的合成 可用寡聚可用寡聚dTdT作为引物，在逆转录酶的催化下，作为引物，在逆转录酶的催化下，开始开始cDNAcDNA链的合成。链的合成。医学资源483、cDNA第二链的合成除去除去cDNA-mRNAcDNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNAmRNA链链( (碱解或碱解或RNaseHRNaseH酶解酶解) )然后以然后

34、以cDNAcDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNAcDNA链链3-3-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成一点开始合成cDNAcDNA第二链第二链( (常用常用KlenowKlenow酶或酶或DNADNA聚合酶聚合酶I I) )切除发夹结构（切除发夹结构（核酸酶核酸酶S1S1，专一性切除单链，专一性切除单链DNADNA）医学资源494、cDNA克隆用于用于cDNAcDNA克隆的载体有三类：克隆的载体有三类： 细菌质粒细菌质粒（如（如pBR322pBR322、 pUCpUC等）插入片段等）插入

35、片段10kb10kb10kb 动植物病毒动植物病毒 根据重组后插入的根据重组后插入的cDNAcDNA能否经转录和翻译合成蛋白质能否经转录和翻译合成蛋白质 非表达型载体非表达型载体（pBR322pBR322及及 gt10 gt10 ） 表达型载体表达型载体（pUCpUC及及 gt11 gt11 ）有利于目的基因的筛选）有利于目的基因的筛选 医学资源505、将重组体导入宿主细胞1 1、转化：、转化：指质粒指质粒DNA DNA 或以它为载体构建的重组或以它为载体构建的重组DNA DNA 导入细菌的过导入细菌的过程。程。 2 2、转染、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。指病毒或以

36、它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 脂质体介导：脂质体介导： 原生质体融合：原生质体融合： 电穿孔：电穿孔： 显微注射：显微注射： 基因枪：基因枪： 病毒介导：病毒介导： 农杆菌转染：农杆菌转染：医学资源516、cDNA文库的鉴定1 1、表型改变：、表型改变： 抗生素抗性抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变）（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变） a a互补：互补： 报告基因：报告基因： 缺陷恢复：缺陷恢复：2 2、结构特征：、结构特征： DNADNA大小：大小： 酶切图谱：酶切图谱： 杂交（核酸、蛋白）：杂交（核酸、蛋白）： PCRPCR检测：检测： DNADNA序列分析序列

37、分析3 3、免疫化学检测：、免疫化学检测：表达产物分析表达产物分析医学资源527、目的cDNA克隆的分离和鉴定从从cDNAcDNA文库中分离特异的文库中分离特异的cDNAcDNA克隆，主要采用：克隆，主要采用：（1 1）核酸探针杂交法。）核酸探针杂交法。 根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从核苷酸作为探针，从cDNAcDNA文库中分离特异文库中分离特异cDNAcDNA克隆。克隆。（2 2）免疫反应鉴定法。）免疫反应鉴定法。 用表达型载体构建的用表达型载体构建的cDNAcDNA文库，可用免疫学方法分组逐文库，可用免疫学

38、方法分组逐一鉴定各一鉴定各cDNAcDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异相应的特异cDNAcDNA克隆。克隆。医学资源53分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定（限制酶图谱、基因测序等）。进一步的验证和鉴定（限制酶图谱、基因测序等）。 不需合成第二链不需合成第二链mRNA逆转录酶ss-DNAPCR特异引物目的cDNA链19851985，PCRPCR发明以后，发明以后，RT-PCRRT-PCR得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。二、逆转录聚合酶链反应法（二、逆转录聚合酶链反应法

39、（ RT-PCR RT-PCR ）医学资源54 三、化学合成法三、化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。氨基酸顺序。人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，505060bp60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变可导致中性突变；三是费用较高。；三是费用较高。医学资源55第四节 基因表达 基因表达基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻

40、：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。译以及所有加工过程。 基因高效表达基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使即获得因表达体系中，使即获得原生物活性原生物活性又可又可高产高产的的表达产物。表达产物。 最佳的基因表达体系最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。医学资源56一、宿主细胞的选择 1 1、培养容易、生长快速培养容易、生长快速： 2 2、容易获得较高浓度的细胞容易获得较高浓度的细胞： 3 3、能利用易得廉价原料能利用易得廉价

41、原料： 4 4、不致病、不产生内毒素不致病、不产生内毒素： 5 5、发热量低、需氧低、适当的发酵温度发热量低、需氧低、适当的发酵温度： 6 6、容易进行容易进行DNADNA重组技术操作重组技术操作： 7 7、产物的产量、产率高产物的产量、产率高： 8 8、产物容易提取纯化产物容易提取纯化：医学资源57 宿主细胞常用两大类：宿主细胞常用两大类： 原核细胞原核细胞：常用有：常用有大肠杆菌大肠杆菌、枯草、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；芽胞杆菌、链霉菌等； 真核细胞真核细胞：常用有：常用有酵母酵母、丝状真菌、丝状真菌、哺乳动物细胞等。哺乳动物细胞等。医学资源58原核细胞 大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原

42、核表达体系。大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优点优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。作、细胞破碎容易。 缺点缺点： 不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难；不足，产品多为胞内产物，提取困难； 蛋白表达后蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）；不能修饰加工（糖基化等）； 产物蛋白质产物蛋白质N N端多余端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应；一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应； 内毒素存留。内毒素存留。 医学资源59 枯草芽胞杆菌：枯草芽胞杆菌： 分泌能

43、力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。胞外蛋白酶对产物降解。 链霉菌：链霉菌： 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。产物可糖基化。医学资源60真核细胞 酵母酵母 是研究基因表达最有效的是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可

44、糖基化。已有不少真核泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。基因成功表达。医学资源61 丝状真菌丝状真菌 优点优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。和后处理工艺。 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 优点优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。的接近天然物。 缺点缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。医学资源62

45、二、大肠杆菌体系中的基因表达（一）表达载体（一）表达载体表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件（1 1）载体能独立地进行复制）载体能独立地进行复制 ( (复制起点，复制起点，ori)ori)（2 2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。动子序列后，以便外源基因表达。（3 3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNARNA聚合聚合酶所识别。酶所识别。医学资源63（4 4）应具有阻遏子）

46、应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。导时才进行转录。 外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响（5 5）应具有很强的终止子）应具有很强的终止子，以便使，以便使RNARNA聚合酶集中聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的因，同时，很强的终止子所产生的mRNAmRNA较为稳定。较为稳定。（6 6）所产生的）所产生的mRNAmRNA必须具

47、有翻译的起始信号，即起必须具有翻译的起始信号，即起始密码始密码AUGAUG和和SDSD序列序列, ,以便转录后能顺利翻译。以便转录后能顺利翻译。 如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子 细菌细菌SD序列序列 起始密码子起始密码子 结构基因结构基因 终止子。终止子。 医学资源64常用表达载体 pBV220系统启动子启动子多克隆位点多克隆位点终止子终止子阻遏子阻遏子P23复制起始位点复制起始位点 它已成功它已成功地表达了地表达了人白人白细胞介素细胞介素2，干扰素干扰素和和肿瘤肿瘤坏死因子坏死因子等外等外源基因。源基因

48、。 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 限制性内切酶限制性内切酶 SD序列序列医学资源65pBV220pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体, ,其组成其组成: : 来源于来源于pUC8pUC8多克隆位点多克隆位点 核糖体核糖体rrnBrrnB基因基因终止信号终止信号 pBR322pBR322第第4225422537353735位位 pUC18pUC18第第20662066680680位位 噬菌体噬菌体cIts857cIts857阻遏子基因阻遏子基因及及P PR R启动子启动子 pRC23pRC23的的P PL L启动子启动子及及SDSD序列序列医学资源66 pBV220p

49、BV220系统优点：系统优点： cIts857cIts857阻遏子基因阻遏子基因与与PLPL启动子启动子同在一个载体上，同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。宿主细胞，使表达产物不易降解。 SDSD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATGATG的外源基因，可表达非融合蛋白；的外源基因，可表达非融合蛋白； 强的转录终止信号可防止出现强的转录终止信号可防止出现“通读通读”现象，现象，有利于质粒有利于质粒- -宿主系统的稳定；宿主系统的稳定；医学资源67 整个质粒仅为整个质粒

50、仅为3.66kb，有利于增加其拷贝，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；数及容量，可以插入大片段外源基因； PR和和PL启动子串联，可以增强启动作用；启动子串联，可以增强启动作用； 本系统为温度诱导，外源基因表达量本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的可达细胞总蛋白的20%20%30%30%；产物以包含；产物以包含体形式存在不易降解均一性好。体形式存在不易降解均一性好。医学资源68PR 和 PL启动子 选用温度敏感突变体选用温度敏感突变体 cItscIts857 857 的基因产物来的基因产物来调控调控 P PL L、P PR R 启动子的转录。启动子的转录。 在较低温