5.0《DNA和蛋白质技术》课件（新人教版-选修1）.ppt

1、新课标人教版课件系列高中生物选修选修专题DNA和蛋白质 技术教学目标教学目标 知识与能力知识与能力 、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，、了解DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性； 、理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。 、二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。 【课题重点与难点课题重点与难点】 课题重点：课题重点： DNA的粗提取和鉴定方法。 课题难点：课题难点： DNA的粗提取和鉴定方法。课题DNA的粗提取与 鉴定专题DNA和蛋白质技术复习巩固:(1)如何观察DNA和RNA在真核细胞中的分布情况?(2)真核细胞DNA的主要存在场所?(3)证明DNA是遗传物质的三个经典实验?(

2、4)DNA分子双螺旋结构模型的提出者是谁?(5)DNA分子双螺旋结构模型的主要特点?1、DNA分子由两条链分子由两条链组成组成,这两条链按反向平这两条链按反向平行的方式盘旋成双螺旋行的方式盘旋成双螺旋结构结构.2、DNA分子中的磷酸分子中的磷酸和脱氧核糖交替连接和脱氧核糖交替连接.排排列在外侧列在外侧,构成基本骨架构成基本骨架,碱基排列在内侧碱基排列在内侧.3、DNA分子两条链上分子两条链上的碱基通过氢键连接成的碱基通过氢键连接成碱基对碱基对.学生活动学生活动1:一、基础知识DNA在在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA的溶解度

3、随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度溶液浓度的 增 加 而 逐 渐 降 低 ； 在的 增 加 而 逐 渐 降 低 ； 在 0 . 1 4 0 . 1 4 mol/Lmol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶液浓度继续增加时，溶液浓度继续增加时，DNADNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。学生活动学生活动2:二、实验方法及注意事项学生活动学生活动3:4、提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤

4、剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？探究活动探究活动4:此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？为了纯化提取的DNA需要将滤液作怎样的进一步处理？为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方案二和方案三的原理有什么不同？学生活动学生活动4: 1.1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）0.1g/mL柠檬酸钠柠檬酸钠100mL活鸡鲜血活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅拌，离心、分离或静置沉淀。离心、分离或静置沉淀。2.2.提取提取DNA。取血细胞取血细胞5-10mL20

5、mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌快速搅拌。纱布纱布过滤过滤：滤液中含：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。和其他核物质，如蛋白质。.提取提取血血细胞核物质：细胞核物质：.溶解核内的溶解核内的DNA：滤液滤液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一个方向，玻棒沿一个方向轻缓轻缓搅拌搅拌。三、实验步骤.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.滤取含滤取含DNA的粘稠物：的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅轻轻搅拌拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水

6、，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。 用多层纱布用多层纱布过滤过滤，含，含DNA的粘稠物留在纱布上。的粘稠物留在纱布上。 20mL2mol/L的的NaCl溶液溶液步骤步骤含含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL烧杯中烧杯中轻缓搅拌轻缓搅拌3min，使尽可能多的，使尽可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液。溶液。.过滤含有过滤含有DNA的的NaCl溶液：溶液：用放有两层纱布的漏斗用放有两层纱布的漏斗过滤过滤步骤步骤所得的溶液，滤液中所得的溶液，滤液中含有含有DNA。.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的DNA：步骤步

7、骤所得的滤液体积分数为所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出现乳）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。面的水分。3.DNA的鉴定：的鉴定：加入二苯胺试剂加入二苯胺试剂4mL，用玻棒，用玻棒搅拌搅拌使使DNA溶解，沸水溶解，沸水浴浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。，观察溶液是否出现浅蓝色。1.共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入加入“两次蒸馏水，两次蒸馏水，三次三次NaCl溶液，一次酒精

8、，一次酒精”三、实验小结三、实验小结四、实验原理拓展介绍。四、实验原理拓展介绍。1.DNA的释放。的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释释放出来的大量放出来的大量DNA与与RNA、蛋白质结合在一起，即释放、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的的不是纯净

9、的DNA，常称为，常称为DNA核蛋白核蛋白。2.DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。在高浓度（在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中并溶解在高浓度的氯化钠溶液中3.DNA的析出与获取。的析出与获取。因为因为DNA在低浓度（在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使液，从而使DNA溶

10、解度下降，蛋白质溶解度增高。溶解度下降，蛋白质溶解度增高。4.DNA的再溶解。的再溶解。用高浓度（用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。粘稠物。5.DNA的沉淀和浓缩。的沉淀和浓缩。 对于除去了蛋白质的对于除去了蛋白质的DNADNA的氯化钠溶液，必须再进的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法酒精沉淀法。即往。即往含有含有NaNa的的DNADNA溶液，加入体积分数为溶液，加入体积分数为95%95%的冷却酒精，混匀后可的冷却酒精，混匀后可以使以使DNADNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNADNA丝

11、状物丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNADNA丝状物可以用玻棒丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附（玻棒有吸附DNADNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。的作用）缓缓旋转的方法卷起。6.DNA的鉴定。的鉴定。100DNA二苯胺二苯胺 蓝色物蓝色物鉴定时蓝色的深浅与溶液中鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。的含量多少有关。方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 2

12、 m1L 的NaCI溶液40mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA的黏稠物 6.将DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入0.015 molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mo

13、l/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗

14、样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )会染成会染成( ) ( ) A. A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提

15、取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以，所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。答：答：D课题多聚酶链式反应扩增 DNA片断 专题DNA和蛋白质技术一、基础知识一、基础知识 （一）、（一）、PCRPCR技术的概念技术的概念 是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的片段的技术，它能以极少量的技术，它能以极少量的DNADNA为模板，为模板，在几小时内复制出上百份的在几小时内复制出上百份的DNADNA拷贝拷贝 （二）、（二）、PCRPCR技术的应用技术的应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物遗传疾病的诊断、刑侦

16、破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定序列测定PCRPCR的应用的应用1 1q从蓝藻里面克从蓝藻里面克隆隆SODSOD( (超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶) )清除人体内细胞中自由基清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰病、早衰食品、保健品、药品、化妆食品、保健品、药品、化妆品品基因库检索基因库检索 SODSOD的序列的序列 设计引物设计引物以蓝以蓝藻总藻总DNADNA位模板做位模板做PCRPCR获得的基因片断连接获得的基因片断连接在表达载体在表达载体原核表达蛋白原核

17、表达蛋白PCRPCR的应用的应用2 2q检测粉末样品检测粉末样品是否含有炭疽杆是否含有炭疽杆菌菌 炭疽菌恐慌，降临美国，炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球席卷全球生命力强、传染快、发作生命力强、传染快、发作快、死亡率高。快、死亡率高。有两对引物是根据编码有两对引物是根据编码炭疽杆菌炭疽杆菌EFEF因子的基因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EFEF因子因子同源。同源。PCRPCR产物是产物是1247bp1247bp和和208bp208bp的片断。非的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养用营养肉汤培养2 2小时小时取培养液直接作取培养液直接作

18、PCRPCRPCRPCR的应用的应用3 3q基因测序基因测序一、基础知识一、基础知识 （三）、（三）、 PCRPCR技术的原理技术的原理1、体内、体内DNA复制的条件：复制的条件：解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物（引物（ RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化催化子链子链合成合成使使DNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸变性（变性（80-100）Taq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）2030个核苷酸构个核苷酸构成成,是一小段是一小段DNA或或RNAATP提供能量提供能量2 2、

19、DNADNA合成的方向合成的方向 （1 1）DNADNA单链两端的命名单链两端的命名基本单位脱氧核苷酸脱氧脱氧核糖核糖磷酸磷酸T1号碳5号碳3号碳连连 接接 ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端（含羟基）3，端5，端DNADNA单链两端的命名单链两端的命名（2 2） DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 DNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNA，而只能从而只能从33端延伸端延伸DNADNA链。链。因此，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。 2 2、DNADNA合成的方向合成的方向（3 3） DNADNA合成的方向合成的方向从子链由从子链由5 5 端向端向

20、 33端延伸端延伸3 3、DNADNA复制的前提复制的前提是是_用用_方法方法 思考：思考：DANDAN复制的前提是什么？复制的前提是什么？ 体体外扩增外扩增DNA DNA 如何打开双链？如何打开双链？ 双链的解开双链的解开控制温度控制温度DNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4、DNA 分子的热变性原理：分子的热变性原理： PCR仪原理仪原理变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合思考：高温使思考：高温使DNADNA解旋，但普通解旋，但普通DNADNA聚合

21、酶会失活聚合酶会失活, ,_找到耐高温找到耐高温DNADNA聚合酶聚合酶P21托马斯托马斯.布鲁克布鲁克5 5、体外、体外DNADNA复制的条件复制的条件( (PCRPCR 反反应的条件应的条件) )DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的两种分别与两条模板链相结合的两种引物；引物；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；耐高温的聚合酶； 控制温度，但不需解旋酶控制温度，但不需解旋酶. . 以便增加大分子模板以便增加大分子模板DNADNA彻底变性彻底变性的概率的概率二、二、PCR的反应过程的反应过程1、循环之前的一次预变性、循环之前的一次预变性2、PCR 一般要经历一般要经历三

22、十多三十多次循环次循环 （1 1）变性：当温度上升到变性：当温度上升到90 90 以上时，以上时，双链双链DNADNA解聚为单链。解聚为单链。 （2 2）复性：温度下降到）复性：温度下降到50 50 左右，两种左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链引物通过碱基互补配对与两条单链DNADNA结合。结合。 （3 3）延伸：温度上升到）延伸：温度上升到7272左右，溶液中左右，溶液中的的四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(A(A，T T，C C，G)G)在在DNADNA聚合聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的新的DNADNA链。链。二、二、PCRPCR的反应过

23、程的反应过程3、每个循环包括、每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（1）PCR循环循环-变性变性9595变性变性（2）PCR循环循环复性复性5555复性复性（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸4、循环特点：、循环特点：上一次循环的产物为下一循环的模板上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代存于两个子代DNADNA分子中分子中 其它子代其它子代DNA

24、DNA分子都为双引物分子式分子都为双引物分子式 处于两引物之间的处于两引物之间的DNADNA序列呈指数增长序列呈指数增长1 12 2N N练习：见课课练练习：见课课练P79第第10题题二、实验步骤：二、实验步骤：准备好准备好PCRPCR反应体系的配方反应体系的配方用微量移液器按配方在微量试管中用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁离心离心1010分钟分钟将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好循环程序仪上，设置好循环程序电泳检测电泳检测PCRPCR结果结果三、操作提示：三、操作提示： 操作提示操作提示 1 1为避免外源

25、为避免外源DNADNA等因素的污染，等因素的污染，PCRPCR实验中实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行在使用前必须进行高压灭菌高压灭菌。 2 2PCRPCR所用的缓冲液和酶应所用的缓冲液和酶应分装成小份分装成小份，并，并在在-20-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在放在冰块上缓慢融化冰块上缓慢融化。 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换枪头都必须更换。所有。所有的成分都加入后，盖

26、严离心管口的盖子，的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微，再将微量离心管放在离心机上，离心约量离心管放在离心机上，离心约10s10s，使反应液，使反应液集中在离心管底部，再放入集中在离心管底部，再放入PCRPCR仪中进行反应。仪中进行反应。目的：目的：避免外源性避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。大量扩增造成假阳性反应。四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有的紫外线波段有一强烈的吸收峰一强烈的吸收峰( (图图5-11)5-11)。可以

27、利用。可以利用DNADNA的这一特点进行的这一特点进行DNADNA含量的测定。含量的测定。四、结果分析与评价四、结果分析与评价(了解了解) 2 2、具体方法如下。、具体方法如下。 1 1）将样品进行）将样品进行5050倍稀释：取倍稀释：取22LPCRLPCR反反应液，加入应液，加入98 98 L L蒸馏水。蒸馏水。 2 2）以蒸馏水作为空白对照，在波长）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将紫外分光光度计处，将紫外分光光度计( (图图5-12)5-12)的读的读数调节至零。数调节至零。 3 3）加入步骤）加入步骤1 1中的中的DNADNA稀释液稀释液100L100L至比色至比色

28、杯中，测定杯中，测定260nm260nm处的光吸收值。处的光吸收值。 4 4）根据下面的公式计算）根据下面的公式计算DNADNA含量。含量。 DNADNA含量含量(g/ml)=50 x(260nmg/ml)=50 x(260nm的读数的读数)x)x稀稀释倍数释倍数五、课题延伸五、课题延伸 1 1、PCRPCR优点：优点： 2 2、PCRPCR技术的意义技术的意义原理虽然复杂，但操作却十分简单。快原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作速、高效、灵活和易于操作 复习：复习：PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别：复制的区别： 1. PCR 1. PCR不需要解旋

29、酶；体内不需要解旋酶；体内DNADNA复制复制需要；需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般要经历三十多次循环，而一般要经历三十多次循环，而生物体内生物体内DNADNA复制需要生物体自身的复复制需要生物体自身的复制。制。 练习1 1、书本、书本2 2、课课练、课课练练习：见课课练练习：见课课练P79P79第第1010题题9 9 下图为下图为PCRPCR过程的前三次循环的图解，请据图回答：过程的前三次循环

30、的图解，请据图回答： ()()请将请将PCRPCR缓冲液中提供的缓冲液中提供的4 4种组分填写在图中的方框内：种组分填写在图中的方框内： (2)(2)第一轮循环中变性第一轮循环中变性 是指是指_；复性；复性 是指是指_ _ ；延伸是指延伸是指_。 (3)(3)假设假设PGRPGR反应中的反应中的DNADNA模板为模板为P P，第一轮循环的产物，第一轮循环的产物2 2个子代个子代DNADNA为为 NlNl，第二轮的产物，第二轮的产物4 4个子代个子代DNADNA为为N2N2，第二轮的产物，第二轮的产物8 8个子代个子代DNADNA为为 N3N3，则，则NlNl、N2N2、N3N3中分别含有模板中

31、分别含有模板DNADNA单链的单链的DNADNA分子分子 ， _、_个，若继续循环个，若继续循环3636次，则次，则N N 3636中将有中将有个个DNADNA分子含有模板分子含有模板DNADNA单链。单链。 (4)N3(4)N3的的8 8个个DNADNA分子中分子中是以是以N2N2中的中的_为模板复制而来的，为模板复制而来的， 是以是以N2N2中的中的 为模板复制而采的，为模板复制而采的，是以是以N2N2中的中的 为模为模 板复制而来的，板复制而来的，是以是以N2N2中的中的 为模板复制而来的。从图中可以为模板复制而来的。从图中可以看出，看出，DNADNA聚合酶只能特异地复制处于聚合酶只能特

32、异地复制处于2 2个引物之间的个引物之间的DNADNA序列，使这段固定长序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增，原因是度的序列呈指数扩增，原因是_ _ 练习：见课课练练习：见课课练P79第第10题题练习二练习二( (课堂检测课堂检测) ) 1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3, ,端端, , _末端为末端为5 5, ,端端, ,在在DNADNA复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端, ,使子链向下延伸使子链向下延伸. . 2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程, ,对应

33、温度分别为对应温度分别为_._.练习二练习二( (课堂检测课堂检测) ) 3 3、一个、一个DNADNA片段经过片段经过3030次循环后能形次循环后能形成成_个这样的片段个这样的片段. . 4 4依据依据DNADNA吸收紫外光的情况吸收紫外光的情况, ,用紫外分用紫外分光光度计测得光光度计测得 DNA=_DNA=_练习二练习二(课堂检测课堂检测)答案答案练习二练习二( (课堂检测课堂检测) ) 1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3, ,端端, , _末端为末端为5 5, ,端端, ,在在DNADNA复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_

34、酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端, ,使子链向下延伸使子链向下延伸. . 2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程, ,对应温度分别为对应温度分别为_._.磷酸基团磷酸基团羟基羟基羟基羟基DNA聚合聚合3/变性、复性、延伸变性、复性、延伸95、55 、72 练习二练习二( (课堂检测课堂检测) ) 3 3、一个、一个DNADNA片段经过片段经过3030次循环后能形次循环后能形成成_个这样的片段个这样的片段. . 4 4依据依据DNADNA吸收紫外光的情况吸收紫外光的情况, ,用紫外分用紫外分光光度计测得光光度计测得 DNA=_DNA=_230l50 x(26

35、0nm50 x(260nm的读数的读数)x)x稀释倍数稀释倍数课题血红蛋白的提取和 分离 专题DNA和蛋白质技术 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳电泳法分离样品的原理法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理

36、和方法凝胶色谱法的原理和方法 样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。和色谱柱的装填。每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少

37、、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。 使微生物的使微生物的蛋白质发生蛋白质发生变性变性、蛋白质的蛋白质的空间结构空间结构被破坏。被破坏。 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行作用，来进行分离。分离。 当相对分子量

38、不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢; ;而相对分子量较大的蛋白质无法进入而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分离。分离蛋白质分离蛋白质 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液

39、的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。, , 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察( () )和科和科 学研究学研究( () )磷酸缓

40、冲液磷酸缓冲液弱酸及其对应的盐：弱酸及其对应的盐：弱碱及其对应的盐：弱碱及其对应的盐：多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐: :缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为能对抗外来强碱的称为共轭酸共轭酸；能对抗外来；能对抗外来强酸的称为强酸的称为共轭碱共轭碱。这一共轭酸碱通常称为。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲对、缓冲剂或缓冲系缓冲剂或缓冲系。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在

41、一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 1 1、在测定蛋白质分子

42、量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰胺在胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具有的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。三维网状结构的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。 （为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可

43、以在凝胶中加入SDSSDS。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩盖。因而掩盖了了，使电泳迁移率完全，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪

44、、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。 1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）一同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为分数为0.90.9的氯

45、化钠溶液洗涤。的氯化钠溶液洗涤。5 5、低速离心、低速离心（低（低速短时间）速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。没有黄色，表明洗涤干净。采集得到鸡血柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/m

46、in的速度离心的速度离心10 10 minmin。第第1 1层（最上层（最上层）：甲苯层（层）：甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色白色薄层固体薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红暗红色色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。磁力搅拌器搅拌器转子搅

47、拌器正在工作 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。利用透析袋透析 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目

48、尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G”G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝胶的交联

49、程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胶膨胀时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。A A、固定：、固定：将色谱柱将色谱柱装置固定在支架上。装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量

50、紧密，以降低、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。凝胶颗粒之间的空隙。 2 2、装填凝胶柱时不得有气泡、装填凝胶柱时不得有气泡存在：存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果。装配好的凝胶柱装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。1 1、液面不要低、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气于凝胶表面，