基因工程制药-PPT课件.ppt

1、第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第一节第一节 概概 述述基因工程制药基因工程制药（genetic engineering pharmaceutics）n是利用基因重组技术将外源基因导入宿是利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大规模培养，以获得主菌或细胞，进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。蛋白质药物的过程。基因工程药物发展历程基因工程药物发展历程l20世纪世纪70年代年代DNA重组技术建立。重组技术建立。l1977年重组生长激素抑制因子克隆成功，美国成年重组生长激素抑制因子克隆成功，美国成立第一家基因工程公司。立第一家基因工程公司。l1982年美国年美国lilly公司首先

2、将重组胰岛素投放市场，公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界上第一个基因工程药物诞生。标志着世界上第一个基因工程药物诞生。l目前，全球上市的基因工程药物有目前，全球上市的基因工程药物有140多种，有多种，有1700多种处于临床研究阶段，多种处于临床研究阶段，2600多种在实验室阶段。多种在实验室阶段。我国基因工程药物我国基因工程药物l我国从我国从20世纪世纪80年代初期开始基因工程药物的开年代初期开始基因工程药物的开发研究。发研究。l1989年第一个基因工程药物干扰素批准上市。年第一个基因工程药物干扰素批准上市。 1b 型基因工程干扰素型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具是由我国自行研制

3、开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过年通过 期临床，并获得国家期临床，并获得国家一类新药一类新药证书，成为证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。物。l1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。l目前已有目前已有20多种基因工程药物上市。多种基因工程药物上市。基因工程药物与传统生物技术的比较基因工程药物与传统生物技术的比较n材料来源困难，无法研制出产品付诸应用。材料来源困难，无法研制出产品付诸应用。n提取纯化成本高，供不应求。提取纯

4、化成本高，供不应求。n由于免疫原性，应用受到限制。由于免疫原性，应用受到限制。传统生物技术药物传统生物技术药物n可可大量生产大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽。如：干扰素多肽。如：干扰素n内源生理活性物质在作为药物使用存在的不足内源生理活性物质在作为药物使用存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改改造造和去除。如：白细胞介素和去除。如：白细胞介素-2基因工程技术生产药物的优点：基因工程技术生产药物的优点：（1 1) )免疫性蛋白免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；，如各种抗原和单克隆抗体；（2 2）细胞因子细

5、胞因子，如干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表，如干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；皮生长因子、凝血因子；（3 3）激素激素，如胰岛素、生长激素、心纳素；，如胰岛素、生长激素、心纳素；（4 4）酶类酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。激活剂、超氧化物歧化酶。（5 5）疫苗疫苗：乙型肝炎疫苗等：乙型肝炎疫苗等基因工程技术可生产的药物和制剂包括：它们的共同点都属于蛋白质。它们的共同点都属于蛋白质。基因工程制药的基本环节n基因克隆示意图基因克隆示意图目的基因 载体DNA(限制性内切

6、酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达l目的基因的制备分离目的基因的制备分离lDNA重组体的构建重组体的构建l重组体导入宿主细胞重组体导入宿主细胞l重组体筛选和鉴定重组体筛选和鉴定l外源基因的表达外源基因的表达l表达产物的分离纯化鉴定表达产物的分离纯化鉴定第二节第二节 基因工程制药基本知识基因工程制药基本知识n将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受将目的基因与载体连接后，转入大肠杆菌等受体细胞，即体细胞，即获得基因工程菌。获得基因工程菌。一、基因工程菌的构建与筛选一、基因工程菌的构建与筛选目的基因 载体DNA(限制性内切酶切开)宿主细胞重组体已转化的宿主细胞n该过程也称为基

7、因工程的该过程也称为基因工程的上游技术上游技术。1、载体（、载体（vector）n载体载体是携带外源目的基因或是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，进入宿主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采用的用的DNA分子。分子。n包括包括质粒载体质粒载体等。等。n外源基因需借助载体的帮助才能进入受体细胞。外源基因需借助载体的帮助才能进入受体细胞。1、质粒载体、质粒载体（plasmid）l质粒质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质（复制能力的遗传物质（DNA分子）。分子）。l存在于几乎所有细菌中

8、，一种存在于几乎所有细菌中，一种自我复制自我复制的的双链环双链环状状DNA分子。能稳定地独立存在于染色体外，并分子。能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。n大小为大小为1300kb，有三种构型：，有三种构型：cccDNA、ocDNA 、lDNA 。质粒的特性质粒的特性1、具有遗传传递和遗传交换的能力、具有遗传传递和遗传交换的能力n可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响。可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响。n可进行可进行独立复制独立复制，并随宿主细胞的分裂传递给后代。，并随宿主细胞的分裂传递给后代。用于克隆表达的质粒须具

9、备以下要素用于克隆表达的质粒须具备以下要素n复制子复制子 又称为复制起始区，包含控制质粒又称为复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点复制起点和和质粒拷贝质粒拷贝数数等遗传因素。等遗传因素。选择性标记选择性标记(seletive marker)l是质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于是质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于筛选转化有质粒的宿主细胞筛选转化有质粒的宿主细胞。l方式：方式：抗生素抗性基因抗生素抗性基因，包括氨苄西林（，包括氨苄西林（Amp）、）、四环素（四环素（Tet）、氯霉素（）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（）、卡那霉素（Kan）和新霉素（和新霉素（Neo）等。）等。l含有

10、质粒的宿主细胞被含有质粒的宿主细胞被赋予赋予拮抗抗生素的表型，拮抗抗生素的表型，能在含抗生素的环境中能在含抗生素的环境中生长。生长。l指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形指质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列，由人工合成。成的序列，由人工合成。l作用：在克隆操作中，在目的基因两端设计限制性内切作用：在克隆操作中，在目的基因两端设计限制性内切酶酶切位点用于插入目的基因。酶酶切位点用于插入目的基因。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSma

11、KpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r多克隆位点多克隆位点（multiple cloning site,MCS)基因工程中常见的各基因工程中常见的各种质粒载体举例种质粒载体举例lpBR322l应用最广泛。应用最广泛。l有抗氨苄青霉素和抗四有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作环素两个抗性基因可作为标记基因。为标记基因。l有许多种常用的限制酶有许多种常用的限制酶的切点。的切点。l它全长它全长4352个核苷酸，个核苷酸，排列顺序已全部测定。排列顺序已全部测定。 （二）目的基因的常用制备方法（二）目的基因的常用制备方法 1 1、化学合

12、成法、化学合成法l采用采用DNA合成仪等将已知序列的目的基因用化学合成方法合成仪等将已知序列的目的基因用化学合成方法直接合成直接合成。 合成前提：合成前提：l较小的蛋白质或多肽的编码基因。较小的蛋白质或多肽的编码基因。l必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。的碱基序列。2、PCR（polymerase chain reaction）n是根据生物体内是根据生物体内DNA复制原理，在复制原理，在DNA聚合酶催聚合酶催化下，依赖化下，依赖DNA模板特

13、异性扩增模板特异性扩增DNA.Kary B Mullisn特点：特点： 可在体外可在体外大量特异性扩增目的大量特异性扩增目的基因基因，实验室常用。，实验室常用。PCR反应成分反应成分1、模板模板DNA；2、引物；、引物；3、四种脱氧核糖核苷酸（、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP） ；4、DNA聚合酶；聚合酶；5、反应缓冲液、反应缓冲液、Mg2+等。等。PCR反应基本步骤反应基本步骤 变性变性： 通过加热使模板通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链高温使双链DNA解离形成单链（解离形成单链（94，30s）。）。 退火

14、退火：当温度降低时，引物与模板当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，（中互补区域结合成杂交分子，（55，30s）。）。 延伸延伸：在在DNA聚合酶、聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，存在下，DNA聚合酶催化引物按聚合酶催化引物按53方向方向延伸，合成出与模板延伸，合成出与模板DNA链互补的链互补的DNA子链，即中温延伸反应（子链，即中温延伸反应（7072，3060s）。）。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循次循环后，目的环后，目的DNA以以2n的形式增加。从而

15、目的基的形式增加。从而目的基因得到大量扩增因得到大量扩增。是目前最为常用的目的基因制备方法。是目前最为常用的目的基因制备方法。三、载体与目的基因的链接三、载体与目的基因的链接n即连接酶催化载体即连接酶催化载体DNA与目的基因与目的基因DNA片段连接，形成重组子（片段连接，形成重组子（recombinant）。）。目的基因 载体DNA(限制性内切酶切开)重组体n该技术称为该技术称为DNA体外重组技术。体外重组技术。连接可分为以下几种类型连接可分为以下几种类型l粘性末端（粘性末端（stiky end）连接）连接 目的基因两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则目的基因两端有与载体上相同的限制性

16、核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，能重新互补结合，在同一限制酶切开产生的粘末端，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。链相连接。 效率较高，较常用。效率较高，较常用。l平头末端平头末端（blunt end）链接：链接： 效率很低（约效率很低（约1/101/100），），T4DNA连接连接酶可催化。酶可催化。四、重组四、重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞l基因工程中常见宿主细胞：基因工程中常见宿主细胞：宿主细胞宿主细胞原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌链球菌链球菌酵母酵母昆虫细胞昆虫细胞哺乳动

17、物细胞哺乳动物细胞植物细胞植物细胞1、重组、重组DNA导入大肠杆菌的方法导入大肠杆菌的方法n1970年，年，Mandel和和Higa发现大肠杆菌经氯化钙处发现大肠杆菌经氯化钙处理，能吸收噬菌体理，能吸收噬菌体DNA，之后，之后Cohen等实现了质等实现了质粒粒DNA转化感受态大肠杆菌转化感受态大肠杆菌受体细胞受体细胞50-100mmol/LCaCl2 氯化钙转化法氯化钙转化法五、重组子的筛选与鉴定五、重组子的筛选与鉴定 1、载体遗传标记法、载体遗传标记法 （1）、抗生素抗性筛选法（最常见）、抗生素抗性筛选法（最常见）抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因抗四环素基因 抗卡那霉素基因等抗

18、卡那霉素基因等 如果如果转化成功转化成功，由于质粒，由于质粒DNADNA上带有上带有AmpAmp抗性基因导致抗性基因导致本来本来AmpAmp敏感的菌株也可以在含有敏感的菌株也可以在含有AmpAmp的固体培养基上的固体培养基上生长，如生长，如图图1 1。 如如转化不成功转化不成功则则AmpAmp敏感的菌株和阴性对照不会在含有敏感的菌株和阴性对照不会在含有AmpAmp的固体培养基上生长，如的固体培养基上生长，如图图2 2。图图1 1图图2 2 蓝白筛选示意图蓝白筛选示意图六、原核细胞表达的特点及选择六、原核细胞表达的特点及选择原核表达系统有原核表达系统有n大肠杆菌大肠杆菌n芽孢杆菌芽孢杆菌n链霉菌

19、链霉菌大肠杆菌（大肠杆菌（ E. coli ）优点：开发最早、研究最成熟优点：开发最早、研究最成熟 遗传学研究深入，基因组序列已明确。遗传学研究深入，基因组序列已明确。 生长迅速，适合大规模生产。生长迅速，适合大规模生产。所以是外源基因表达的首选表达系统。所以是外源基因表达的首选表达系统。中心法则中心法则2、外源基因在大肠杆菌中的表达形式、外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可位于以下三个区域：表达产物可位于以下三个区域：l胞内胞内l周质周质l胞外胞外大肠杆菌电镜照片大肠杆菌电镜照片l胞内表达有两种表达形式，即胞内表达有两种表达形式，即非融合蛋白非融合蛋白和和融融合蛋白合蛋白。由由两种两种蛋

20、白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。胞内胞内l非融合蛋白非融合蛋白是指表达的外源蛋白的是指表达的外源蛋白的N端不含任何端不含任何大肠杆菌的多肽序列。大肠杆菌的多肽序列。融合蛋白融合蛋白是指将外源基是指将外源基因融合至某种特定基因的下游，表达的外源蛋因融合至某种特定基因的下游，表达的外源蛋白白N端含原核多肽。端含原核多肽。分泌表达分泌表达n方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白方法：通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽信号肽序序列的下游。列的下游。融合蛋白（含信号肽和外源蛋白）融合蛋白（含信号肽和外源蛋白）在跨过在跨过膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分

21、泌至细胞膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分泌至细胞周质空间或胞外。周质空间或胞外。n外源基因高效表达，可达大肠杆菌总蛋白的外源基因高效表达，可达大肠杆菌总蛋白的1070%，易形成包涵体，故采用分泌表达易形成包涵体，故采用分泌表达。什么是包涵体？什么是包涵体？l原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快原因细胞的外源蛋白质，蛋白合成速度太快(可达大肠杆菌可达大肠杆菌总蛋白的总蛋白的1070% )，以至于没有足够的时间进行折叠，二，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合过多的蛋白间的非特异性结合，蛋，蛋白质无法达到足够的溶解度等。白质无法

22、达到足够的溶解度等。l这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。l大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下，大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下，有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠杆菌有一个突起。杆菌有一个突起。细胞内包涵体细胞内包涵体什么是信号肽？什么是信号肽？n分泌蛋白新生肽链分泌蛋白新生肽链N端的一段端的一段2030氨基酸残氨基酸残基组成的肽段。基组成的肽段。n用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）。用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）。七、真核细胞表达的特点七、真核细胞表达的特点n

23、原核表达的缺点原核表达的缺点 缺乏蛋白翻译后加工修饰系统缺乏蛋白翻译后加工修饰系统，影响外源蛋白生物活性。，影响外源蛋白生物活性。以以包涵体形式存在包涵体形式存在，须经变性，复性处理。，须经变性，复性处理。外源蛋白在原核生物中外源蛋白在原核生物中不稳定不稳定。n真核生物和原核生物真核生物和原核生物基因表达过程示意图基因表达过程示意图常用的真核表达系统常用的真核表达系统l酵母表达系统酵母表达系统l昆虫表达系统昆虫表达系统l哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统1、酵母表达系统、酵母表达系统n基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为基因工程中应用最广泛的酵母表达系统为巴斯德毕赤巴斯德毕赤酵母。酵母。

24、巴斯德毕赤酵巴斯德毕赤酵母结构模式图母结构模式图巴斯德毕赤酵母简介巴斯德毕赤酵母简介l是是甲醇营养型甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。唯一碳源和能源的酵母菌。 l1987年，年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg）。）。 巴斯德毕赤酵母主要优点为巴斯德毕赤酵母主要优点为l高表达量高表达量l高稳定性高稳定性l翻译后修饰功能翻译后修饰功能l分泌表达分泌表达3、哺乳动物细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统n蛋白质正确折叠，具有蛋白质翻译后加工功能。蛋白质正确折

25、叠，具有蛋白质翻译后加工功能。所以外源蛋白在结构、理化性质和生物功能最所以外源蛋白在结构、理化性质和生物功能最为接近天然的高等生物。为接近天然的高等生物。哺乳动物细胞表达系统的表达载体哺乳动物细胞表达系统的表达载体n病毒载体病毒载体n质粒载体质粒载体常用哺乳动物细胞株常用哺乳动物细胞株nCHO细胞细胞n骨髓瘤细胞株骨髓瘤细胞株基因重组蛋白的分离纯化和分基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定析鉴定分离纯化技术应满足以下要求分离纯化技术应满足以下要求l技术条件要温和技术条件要温和n选择性要好选择性要好n回收率要高回收率要高n分离纯化过程要快分离纯化过程要快（一）基因重组蛋白主要的分离技术（一）基因重组蛋

26、白主要的分离技术1.离心离心实现固液分离实现固液分离分离细胞、细胞碎片、包涵体和病毒颗粒分离细胞、细胞碎片、包涵体和病毒颗粒2.蛋白沉淀蛋白沉淀利用某些方法使蛋白质沉淀，再离心分离利用某些方法使蛋白质沉淀，再离心分离等电点沉淀法等电点沉淀法盐析法，常用硫酸铵盐析法，常用硫酸铵等电点沉淀法等电点沉淀法 l原理原理：在等电点时，蛋白质分子：在等电点时，蛋白质分子净电荷为零净电荷为零(即正负电荷即正负电荷相等相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的没有相同电荷的相互排斥相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰

27、撞、凝聚而产生沉淀。凝聚而产生沉淀。盐析法的原理盐析法的原理l蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表蛋白质分子表面离子周围的水分子数目面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度。分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度。l简单的说就是将简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。去除而沉淀。 l加入高浓度中

28、性盐后，由于中性盐与水分子的亲加入高浓度中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。减弱乃至消失。 3.膜分离膜分离n是指用半透膜是指用半透膜（semi-permeable membrane） （如醋（如醋酸纤维素膜）作为选择性障碍层，使溶液中某些组份酸纤维素膜）作为选择性障碍层，使溶液中某些组份通过，而截留其它组分的分离方法。通过，而截留其它组分的分离方法。（1）透析）透析l 透析透析 是指分子量较小的分子或离子（如生理上的电解质）能是指分子量较小的分子或离子（如生理上的电解质）能够穿透半透性膜（够穿透半透

29、性膜（semi-permeable membrane）析出，较）析出，较大的分子就不能通过半透膜。大的分子就不能通过半透膜。 n透析可用于透析可用于脱盐脱盐和和去除杂蛋白去除杂蛋白。（二）基因重组蛋白的主要纯化技术（二）基因重组蛋白的主要纯化技术n主要是主要是层析法层析法层析层析(chromatography) n基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。而将混合组分分离的技术。n当流动相当流动相(液体或气体液体或气体)流经固定相流经固定相(多孔的固体或覆盖多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体在固体支持物上的液体)时，各

30、组分沿固定相移动的速时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。度不同而分离。n能用于微量样品的分析和大量样品的纯化能用于微量样品的分析和大量样品的纯化 制备。制备。 1.离子交换层析离子交换层析(ion-exchange chromatography) n根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。即根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。即不同蛋白质在一定不同蛋白质在一定pH下所带电荷不同，与分离介质上的离下所带电荷不同，与分离介质上的离子化基团结合能力也不同，从而实现分离纯化子化基团结合能力也不同，从而实现分离纯化。n分为分为阳离子阳离子交换和交换和阴离子阴离子交换层析等。交换层

31、析等。n优点优点：操作容易，应用广泛，是基因工：操作容易，应用广泛，是基因工程蛋白质药物分离纯化的重要方法。程蛋白质药物分离纯化的重要方法。n缺点缺点：特异性不强：特异性不强2.亲和层析亲和层析(affinity chromatography) n在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如识别并结合，如酶与底物酶与底物的识别结合、的识别结合、受体与配体受体与配体的识别结的识别结合、合、抗体与抗原抗体与抗原的识别结合。的识别结合。n这种结合具有特异性和专一性的，又具可逆的，这种结合具有特异性和专一性的，又具可逆的， 改变

32、条件改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和亲和力力。优点：纯化后优点：纯化后纯度高纯度高，可去除大多数杂蛋白。，可去除大多数杂蛋白。缺点：难找到合适的层析介质，缺点：难找到合适的层析介质，成本高，应用范成本高，应用范 围不广围不广。3. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) n凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状来实现分离纯化。据蛋白质的大小和形状来实现分离纯化。n所用凝胶颗粒是所用凝胶颗粒是惰性

33、惰性不带电荷的不带电荷的多孔网状多孔网状支持物。支持物。4.疏水色谱疏水色谱n利用蛋白质分子的利用蛋白质分子的疏水性差异疏水性差异来实现分离。来实现分离。 固定相固定相疏水基团疏水基团蛋白质上的疏水区域蛋白质上的疏水区域丙氨酸丙氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸色氨酸色氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸RP-HPLC色谱柱色谱柱人血浆中不同蛋白分离色谱图人血浆中不同蛋白分离色谱图 基因工程药物质量控制基因工程药物质量控制一、基因工程药物质量控制要点一、基因工程药物质量控制要点l蛋白质含量测定蛋白质含量测定l蛋白质纯度检测蛋白质纯度检测l蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定l蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定l蛋白质序列分析蛋白

34、质序列分析l杂质分析杂质分析蛋白质含量测定方法蛋白质含量测定方法n色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸在在280nm波长波长附近有吸收峰，附近有吸收峰，蛋白质中含有这些芳香族氨基蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，故蛋白质在酸，故蛋白质在280nm处有特处有特征吸收，故测定征吸收，故测定280nm处的吸处的吸光度值可计算蛋白含量。光度值可计算蛋白含量。1.紫外吸收光谱法紫外吸收光谱法标准曲线2.BCA法（Bicinchoninic Acid） 形成一个在形成一个在562nm处有最大吸光度的紫色复合物，其处有最大吸光度的紫色复合物，其吸光度与蛋白质浓度成正比。吸光度与蛋白质浓度成正比。

35、3.Lowry法nFolin-酚法所用的试剂（酚法所用的试剂（ Folin-酚试剂）由两部酚试剂）由两部分组成。分组成。n试剂甲：其中的试剂甲：其中的Cu可与蛋白质中的肽键形成复合可与蛋白质中的肽键形成复合物。物。n试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液，复合物可与其试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液，复合物可与其产生蓝色。产生蓝色。4.考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（coomassie brilliant blue）n染料考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后引起染与蛋白质结合后引起染料颜色改变为蓝色，在料颜色改变为蓝色，在595nm处有最大吸收，处有最大吸收，光吸收增加，因此大大提高了测定蛋白质的灵

36、光吸收增加，因此大大提高了测定蛋白质的灵敏度（敏度（1ug）n目前应用很广。目前应用很广。 蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定SDS-聚丙烯凝胶法（聚丙烯凝胶法（SDS-PAGE)n即十二烷基硫酸钠即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法。n在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），），SDS加入到电泳系加入到电泳系统中能结合到蛋白质分子上，统中能结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质使各种蛋白质SDS复合物都复合物都带上相同密度的带上相同密度的负电荷负电荷，其数，其数量远远超过了蛋白质分子原有量远远超过了蛋白质分子

37、原有的电荷量，从而掩盖了不同种的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。类蛋白质间原有的电荷差别。n此时，蛋白质分子的电泳迁移此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要率主要取决于它的分子量大小取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。响几乎可以忽略不计。 蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定测定方法测定方法nSDS-PAGEn凝胶过滤n质谱法（最为准确，成本也较高） 蛋白质序列分析蛋白质序列分析lN-端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析Edman法，测定重组蛋白法，测定重组蛋白N-端端15个氨基酸。个氨基酸。lC-端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析羧

38、肽酶法，测定重组蛋白羧肽酶法，测定重组蛋白C-端端3个氨基酸左右。个氨基酸左右。第五节 基因工程制药应用实例胰岛素（insulin）1.简介n是一种蛋白质类激素，胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。2.胰岛素的发现n胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。n1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。n1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列，开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。n1965年9月17日，中国科

39、学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质。 n70年代初期，英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定了猪胰岛素的立体结构。 n1979年，胰岛素的基因被克隆。 胰岛素的结构与性质n不同种族动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素功能大体相同，成分稍有差异。图中为人胰岛素人胰岛素化学结构。 n胰岛素由A、B两个肽链组成。 A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸，共51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之

40、间也存在一个二硫键。 n多克隆位点二.制备工艺n1982年，基因工程胰岛素问世。1.基因的构建与表达n目前表达系统主要有两种：大肠杆菌和酵母表达系统。n大肠杆菌表达系统的 优点：表达量高，表达出包涵体。 缺点：表达出的胰岛素无生物活性n酵母表达系统的 优点：二硫键正确，不需要复性加工处理。 缺点：产量低，发酵时间长。大肠杆菌表达胰岛素原n90年代初礼来公司通过先表达出胰岛素原再通过酶切得到具有活性的胰岛素。分离纯化得到胰岛素原分离纯化得到胰岛素原mRNA反转录得到反转录得到胰岛素原胰岛素原cDNA构建重组质粒构建重组质粒转化大肠杆菌，构建工程菌转化大肠杆菌，构建工程菌发酵，表达发酵，表达纯化得胰岛素原融合蛋白纯化得胰岛素原融合蛋白酶切得具活性胰岛素酶切得具活性胰岛素酵母表达胰岛素原n诺和诺德公司开发，细胞表达微小胰岛素原（几个氨基酸取代了C肽），经转录后修饰成具有正确二硫键的微小胰岛素原，分泌到胞外，经分离纯化得到。大肠杆菌（大肠杆菌（枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌n分泌能力强分泌能力强,可以将产物直接分泌到培养液中可以将产物直接分泌到培养液中,不不形成包含体形成包含体.n有很强的胞外代谢酶有很强的胞外代谢酶,对产物进行不同降解对产物进行不同降解,应用应用受到影响受到影响.酵母菌的结构酵母菌的结构病毒的结构示意图病毒的结构示意图病毒的形态病毒的形态