转基因检测国家局培训教材(基因成分检测)课件.ppt

1、 食品中转基因成分、真伪鉴别和过敏原及其成分检测质检系统实验室技术能力培训教材主要内容主要内容 食品中转基因成分检测 食品中过敏原及其成分检测 食品真伪鉴别（动物源性成分检测）第一部分第一部分 食品中转基因成分检测食品中转基因成分检测一、全球转基因作物种植情况一、全球转基因作物种植情况和有关法规介绍和有关法规介绍全球转基因作物种植面积全球转基因作物种植面积（1996-2009）2009年年不不同同国国家家转转基基因因作作物物种种植植面面积积19961996年到年到20092009年年美国转基因美国转基因作物的种植百分率作物的种植百分率巴西、加拿大、中国、印度巴西、加拿大、中国、印度转基因作物占

2、作物种植面积的比例转基因作物占作物种植面积的比例从08年的80%增长到09年的87%从2008年的86%增加到2009年的93%棉花种植量减少，但仍为68%从2008年的65%增加到2009年的71%9种植国家不断增多种植国家不断增多9商业化种植：商业化种植：美洲、亚洲、美洲、亚洲、大洋洲、大洋洲、欧洲、非洲欧洲、非洲2525国国 1010大大 豆豆, 57玉玉 米米, 25棉棉 花花, 13油油 菜菜, 5转基因作物种植比例转基因作物种植比例2009年年喷施草甘膦前喷施草甘膦后抗草甘膦油菜RT73非转基因油菜中国培育的转基因抗虫水稻Bt63介绍Bt63母本对照母本对照转基因产品标识制度转基因

3、产品标识制度标识类标识类别别标识阈标识阈值值国家国家/ /地区地区强制性标识0中国、印度、菲律宾、印度尼西亚0.9%欧盟、爱尔兰、以色列1%澳大利亚、新西兰、巴西、南非、斯洛文尼亚、克罗地亚、捷克共和国、瑞士、俄罗斯、沙特阿拉伯2%智利、挪威3%韩国、马来西亚5%日本、中国台湾、泰国自愿性标识5%中国香港、美国、加拿大、阿根廷 2001年5月23日，国务院发布了第304号令农业转基因生物安全管理条例农业转基因生物安全管理条例农业转基因生物安全管理条例标识的标注方法标识的标注方法转基因动植物（种子、种畜禽、水产苗木）和微生物，转基因动植物（种子、种畜禽、水产苗木）和微生物，直接标注直接标注“转基

4、因转基因”。 转基因农产品的直接加工品转基因农产品的直接加工品,标准为标准为“转基因转基因XX加工品加工品（制成品）（制成品）”或或“加工原料为转基因加工原料为转基因XX” 用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成分的产品标注为不出转基因成分的产品标注为“本产品为转基因本产品为转基因XX加工加工制成，制成， 但本产品中已不再含有转基因成分但本产品中已不再含有转基因成分”或或“本产品本产品加工原料中、加工原料中、 有转基因有转基因XX

5、，但本产品中已经不再含有转，但本产品中已经不再含有转基因成分基因成分” 农业转基因生物标识管理办法农业转基因生物标识管理办法2002年颁布实施年颁布实施第一批标识管理的转基因生物第一批标识管理的转基因生物（5 5大类大类1717种）种）大豆种子，豆粒，豆粉，豆油，豆粕玉米种子，玉米粒，玉米粉，玉米油，玉米面油菜种子，油菜籽，菜籽油棉花种子番茄种子，新鲜番茄，番茄酱转基因检测国家标准转基因检测国家标准序序 号号 标准号标准号 国家标准名称国家标准名称 1 GB/T19495.1-2004转基因产品检测转基因产品检测通用要求和定义通用要求和定义2 GB/T19495.2-2004转基因产品检测转基

6、因产品检测实验室技术要求实验室技术要求3 GB/T19495.3-2004转基因产品检测转基因产品检测核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法4 GB/T19495.4-2004转基因产品检测转基因产品检测核酸定性核酸定性PCR检测方法检测方法5 GB/T 19495.5-2004转基因产品检测转基因产品检测核酸定量核酸定量PCR检测方法检测方法6 GB/T19495.6-2004转基因产品检测转基因产品检测基因芯片检测方法基因芯片检测方法7 GB/T19495.7-2004转基因产品检测转基因产品检测抽样和制样方法抽样和制样方法8 GB/T19495.8-2004转基因产品检测转基因产品检测蛋白质检

7、测方法蛋白质检测方法二、以核酸为基础的检测方法介绍二、以核酸为基础的检测方法介绍 主要内容主要内容1.核酸提取纯化方法2.定性检测方法3.定量检测方法4.可能产生误差的原因及消除5.案例分析1.1.核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法使用标准方法使用标准方法GB/T 19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法A 酚-氯仿法提取DNAB PVP法提取DNA（Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮）聚乙烯吡咯烷酮）C CTAB法提取DNA （Cetyltrimethyle Ammonium Bromide,十六烷基三乙基溴化铵）十六烷基三乙基溴化铵） D 硅土法提取DNA

8、E 胍-氯仿法提取DNA建议使用商业试剂盒核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法 酚-氯仿法提取DNA、胍-氯仿法提取DNA利用酚和胍使蛋白质变性，释放出核酸,同时抑制了DNase的降解作用，保护核酸。利用氯仿加速有机相与液相分层。 PVP法提取DNA、 CTAB法提取DNA 利用高浓度去垢剂在高温（5565）条件下裂解细胞，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，得到水相中的核酸。 硅土法提取DNA利用硅土对核酸的吸附作用，分离核酸。转基因产品的检测策略转基因产品的检测策略 Strategy for GMO Detection

9、转基因转基因transformationPlant genomePlant genome品系特异性检测品系特异性检测Event Specific Detection结构特异性检测结构特异性检测Construct Specific Detection植物基因组Recipient genome重组产生重组产生GMORecombinant Plant作物种属检测作物种属检测Taxon detection增强子增强子Enhancer筛选筛选 检测检测Screen detection基因Gene终止子终止子Terminator启动子启动子Promoter筛选筛选 检测检测Screen detection

10、GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法使用标准方法使用标准方法主要内容主要内容本标准方法规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的定性检测。从以下五个方面进行介绍：A.方法简介B.检测目标物C.检测体系D.结果判定E.结果表述A.A.方法简介方法简介 普通普通PCR+PCR+电泳方法电泳方法 原理 聚合酶链式反应（PCR）在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下经循环反应对目标序列进行复制。 PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳方法依据DNA分子长度的不同加以分离。A.A.方法简介方法简介 缺点：

11、1. 普通PCR灵敏度可达到0.1，而实时荧光PCR检测下限可达到0.01。2. 电泳存在EB等致癌物质，需要特殊处理。3. 检测时间长。B.B.检测目标物检测目标物1物种特异性检测方法 大豆、番茄、玉米、油菜、马铃薯、棉属作物、真核生物18SrRNA、叶绿体多拷贝DNA序列检测方法。2筛选检测方法： CaMV35S启动子、 NOS终止子、 NPTII基因、FMV 35S启动子筛选检测方法。3结构基因特异性检测方法 抗草甘膦大豆、转基因番茄Zeneca、转基因玉米Bt11、Bt176、T25、转基因马铃薯New Leaf Plus、New Leaf Y结构基因特异性检测方法。4品系特异性检测方

12、法 转基因玉米MON810、抗草甘膦油菜RT73品系特异性检测方法、棉花MON531、华番一号。C.C.检测体系检测体系D.D.结果判定结果判定PCR检测时应做平行对照，两份平行样品结果应保持一致。如果一个样品结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。可以通过增加PCR反应中DNA的模板量使两份平行样结果一致。所检测目标片段出现扩增，且PCR产物经过确认，所有对照结果正常，结果判定为阳性，所检测目标片段未出现扩增;所有对照结果正常，结果判定为阴性。一般要求 实验结果不能用“+/”来表述。 阴性结果不能用“不含GMO”（“GMOnotpresent”）来表述。E.E.结果表述结果表述阴性结果的

13、表述阴性结果的表述测试报告应该包括下列内容： “对于X物种，未检测出转基因成分。 根据xxx（即标准参照物质），该方法的检测下限为X%。” 英文表述为： “ForspeciesX,GMOderivedmaterialwasnotdetected. TheLODofthemethodisX%determinedwithxxx(identifythereferencematerial).” 测试报告应该包括下列内容： “对于X物种，检测出转基因成分。” 英文表述为： “ForspeciesX,thepresenceofGMOderivedmaterialwasdetected.”阳性结果的表述阳性

14、结果的表述3. 核酸定量PCR检测方法使用标准方法使用标准方法GB/T 19495.5-2004GB/T 19495.5-2004转基因产品检测转基因产品检测 核酸定量核酸定量PCRPCR检测方法检测方法本标准方法规定了转基因成分核酸定量检测方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的实时荧光PCR定量检测。从以下五个方面进行介绍：主要内容主要内容 A.方法原理简介 B.检测目标物 C.检测体系 D.定量计算 E.结果表述 实时荧光PCR方法： 优点：1.快速 2.灵敏 3.污染小A.方法原理简介方法原理简介实时荧光实时荧光PCR的原理的原理RQ扩增曲线：域值和扩增曲线：域值和Ct值值

15、SampleNo TemplateThresholdBaselineRn+Rn-CtEVENT176玉米中CryIA(b)标准曲线B.检测目标物检测目标物1. 转基因大豆GTS-40-3-2；2. 转基因玉米MON810、Bt176、Bt11及GA21；3. 转基因油菜RT73。试剂名称终浓度10PCR反应缓冲液1MgCl22.5mmol/LdNTPs(含dUTP)0.2mmol/LUNG酶*0.075U引物(上游)0.2mol/L引物(下游)0.2mol/L探针0.1mol/LTaq酶*2.5UDNA模板(20ng30ng/L)5L补水至50L*DNA模板可视加工程度适当增加模板量。C.检测

16、体系检测体系转基因产品含量（转基因产品含量（% %）测试样品中外源基因的拷贝数测试样品中外源基因的拷贝数100%100%测试样品中内源基因的拷贝数测试样品中内源基因的拷贝数D.定量计算定量计算E.结果表述结果表述定量检测结果有4种情况，每种检测结果表述如表检测结果检测结果结果表述结果表述未检出物种内源特异性基因未检出物种内源特异性基因该样品未检出该样品未检出XX物种内源特异物种内源特异DNA成分成分检出物种内源特异性基因，但未检检出物种内源特异性基因，但未检出目标外源基因片段出目标外源基因片段该样品未检出转基因成分，定量方法检测该样品未检出转基因成分，定量方法检测限为限为X%检出物种内源特异性

17、基因和目标外检出物种内源特异性基因和目标外源基因片段，但含量小于定量方法源基因片段，但含量小于定量方法检测限检测限该样品中该样品中XX转基因成分低于本定量方法检转基因成分低于本定量方法检测限（测限（X%）检出物种内源特异性基因，目标外检出物种内源特异性基因，目标外源基因含量在标准曲线范围内源基因含量在标准曲线范围内（1）在组分）在组分A中，中，XX转基因成分为转基因成分为X%；（2）若在多个组分中检出转基因成分，）若在多个组分中检出转基因成分，应分别报告每个组分的转基因成分含量：应分别报告每个组分的转基因成分含量：“组分组分A的的XX转基因成分为转基因成分为X%，组分，组分B的的XX转基因成分

18、为转基因成分为Y%”4.4.可能产生误差的原因及消除可能产生误差的原因及消除试验结果可能受到提取样品DNA、反应体系及条件及试验环境等方面的影响，为保证试验结果的准确性从以下三个方面进行论述： （1） （2） （3）（1）核酸提取的质量控制对照的设置：每个检测样品设置两个提取平行样。 提取空白对照：以水代替样品，避免化学试剂污染而影响。 提取阴性对照 提取阳性对照DNA检测：可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的质量；用核酸蛋白测定仪来测定DNA浓度，但这不是必须的。要检测内源基因来判断所提取的DNA是否适合PCR扩增。（2 2）定性）定性PCRPCR检测的质量控制检测的质量控制 PCR检测反应

19、要设置平行实验，两份平行的测试结果应保持一致，否则要重新进行检测。 PCR检测反应要设置试剂空白对照、阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照、提取空白对照。 检测反应完成后，若所有对照结果正常，所检测目标DNA出现扩增，结果判断为阳性，所检测目标DNA未出现扩增，结果判断为阴性。（3 3）定量）定量PCRPCR检测的质量控制检测的质量控制标准曲线的质量影响度量的不确定性。标准曲线上每个浓度应做3个平行。每批测试实验需要设置对照如：空白对照、阳性对照、阴性对照，以及PCR抑制物对照，所有对照的结果中若有一项不符合者，测试结果应放弃重做实验。每个重复的测试样品测试结果（转基因成分含量）的相对相差大

20、于或等于35%，测试结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做试验。应用Passive Reference Dye （ROX）、阳性内对照(IPC) 、标准曲线及重复样品可保证定量PCR检测的质量。重复样品重复样品 定量的结果需要进行统计学处理：平均值和标准偏差。 需要重复实验，每个样品重复3次以上，以满足统计学的要求去除定量误差。（3）定量）定量PCR检测的质量控制检测的质量控制5.5.案例分析案例分析 案例一 转基因大豆、玉米检测 案例二 转基因大米Bt63检测案例一案例一 转基因大豆、玉米检测转基因大豆、玉米检测 1.样品处理-碾磨成细粉 美国联邦谷物检验署(FGIS)使用的碾磨机SPEX

21、冷冻研磨机系列冷冻研磨机系列 防止污染效果好 快速 超细 需要液氮2. DNA2. DNA提取提取定性PCR检测试剂盒，推荐：（1）宝生物工程(大连)有限公司产品 TaKaRa PCR Amplification Kit（2）天根生化科技（北京）有限公司产品（3）Promega 公司产品实时荧光PCR检测试剂盒，推荐：（1）宝生物工程(大连)有限公司产品（2）天根生化科技（北京）有限公司产品（3）AB 公司产品 3 3、PCRPCR扩增扩增 内参照基因: 18S rRNA, Lectin, Zein, IVR, SPS 筛选检测:CaMV 35S, Nos, NptII,Bar,FMV35s,

22、 Pat 先筛选： CaMV 35S, NOS, NPTII等基因。玉米还要检测Bar,PAT等，视转基因材料的背景情况决定。 阳性样品阴性样品Ct 值 如果未检测出，就报告未检出 XXX 基因。 如果检测出以上筛选基因，需再进行品系检测。 品系特异性检测： 大豆：GTS40-3-2, Mon89788, A2704. 玉米：Bt176, Mon810, Bt11, GA21, T25， Mon863, Nk603, Tc1507等。案例二案例二 转基因大米转基因大米Bt63Bt63检测检测 出口到欧盟国家按照国家局质检食函200893号关于做好输欧大米及米制品转基因BT63项目检测工作的紧急

23、通知来执行，方法原文来自：Bt63Bt63大米检测引物和探针序列大米检测引物和探针序列证书格式证书格式 兹证明上述产品已按照欧盟D.MADE的检测方法进行检测，不含有转Bt63基因成分。 This is to certify that products described above have been tested according to European Union D.MADE method and free from genetically modified Bt63.三、以蛋白为基础的检测方法介绍三、以蛋白为基础的检测方法介绍 样品的预处理 取取500g500g以上大豆，粉碎、微孔

24、滤膜过滤。以上大豆，粉碎、微孔滤膜过滤。 微孔滤膜孔径为微孔滤膜孔径为450450微米，保证孔径小于微米，保证孔径小于450450微米的粉末质量占大豆样品质量的微米的粉末质量占大豆样品质量的90%90%。 蛋白检测检测方法蛋白检测检测方法GB/T 19495.8-2004 GB/T 19495.8-2004 转基因产品检转基因产品检测测 蛋白质检测方法蛋白质检测方法蛋白质抽提流程蛋白质抽提流程程序程序详细说明详细说明称量称量称量称量0.5g0.5g测试样品、空白、参照标准测试样品、空白、参照标准加缓冲液加缓冲液加入加入4.5mL4.5mL抽提缓冲液抽提缓冲液混匀混匀使测试样品与抽提缓冲液充分混

25、匀，高使测试样品与抽提缓冲液充分混匀，高脂粉末低于脂粉末低于5min5min，低脂粉末、分离蛋，低脂粉末、分离蛋白质白质15min15min以上以上离心离心在在44以以5000g5000g将样品离心将样品离心15min15min，吸取，吸取上清液到另一干净离心管中上清液到另一干净离心管中稀释稀释根据基质不同以根据基质不同以1:3001:300或或1:101:10稀释，稀稀释，稀释测试样品、空白、参照标准释测试样品、空白、参照标准酶联免疫吸附酶联免疫吸附法法 (ELISA)ELISA实验流程实验流程程序 体积详细说明加样100L微量移液器吸取已稀释的样品溶液、空白、阴性和阳性标准品至相应酶标孔孵

26、育-37孵育1h洗涤-用洗涤缓冲液洗涤3次加样100L向每个酶标孔中加入偶联抗体孵育-37孵育1h洗涤-用洗涤缓冲液洗涤3次加样100L向每个酶标孔中加入显色底物孵育-室温孵育10min加样100L向每个酶孔中加入终止液混匀-轻轻混匀10s测量吸光度用酶标仪测量每孔在450nm的吸光度结果可信度判断的条件结果可信度判断的条件空白对照空白对照OD450nm0.30OD450nm0.30阴性标准品阴性标准品OD450nm0.30OD450nm0.302.5%2.5%阳性标准品阳性标准品OD450nm0.8OD450nm0.8所有阳性标准品，所有阳性标准品，ODOD值值重复的重复的ODOD值差异值差异15%15%重复的重复的CV15%CV15%未知样品、溶液未知样品、溶液重复的重复的CV20%CV20%重复的浓度值差异重复的浓度值差异20%20%酶联免疫检测方法的技术参数 方法检测的灵敏度为方法检测的灵敏度为0.1%0.1% 定量的线性范围定量的线性范围0.5%-3%0.5%-3%转基因大豆试纸条检测转基因大豆试纸条检测 GB/T 19495.8-2004GB/T 19495.8-2004转基因产品中转基因产品中Cry1Ab/AcCry1Ab/Ac蛋白蛋白的试纸条检测的试纸条检测试纸条方法试纸条方法适合于田间、仓库现场检测适合于田间、仓库现场检测谢谢大家谢谢大家