生化分析-化学检测技术课件.ppt

1、化学检测技术化学检测技术化学与生命科学学院化学与生命科学学院生化检测分析生化检测分析 化学检测是根据物质的化学性化学检测是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定质而对物质进行定性、定量测定的方法。的方法。第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。三种元素组成的一大类化合物。 自然界中糖类包括多糖、双糖、单糖自然界中糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有单糖和某些双糖具有游离羰基游离羰基还原糖还原糖 多糖和蔗糖等无还原性多糖和蔗糖等无还原性非还原糖非还原糖一、定义和分类一、定义和分类

2、二、糖类的化学检测原理二、糖类的化学检测原理 糖类化学检测主要是利用糖类化学检测主要是利用游离羰基游离羰基的的还原还原性质性质，与试剂（，与试剂（氧化剂氧化剂）进行氧化还原反）进行氧化还原反应而进行测定的。应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。 最常用的试剂：最常用的试剂：斐林（斐林（FehlingFehling）试剂）试剂 斐林试剂斐林试剂基本组成：基本组成： A：CuSO4 溶液溶液 B：NaOH和酒石酸钾钠和酒石酸钾钠 溶液溶液 使用时使用时A、B等体积混合等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）生成酒石酸钾钠铜）424NaSOCu(OH)CuS

3、ONaOH2OH2CuCOONa CHO CHO COOKCOONa CHOH CHOH COOKCu(OH)22酒石酸钾钠铜是酒石酸钾钠铜是氧化剂氧化剂，可与还原糖的，可与还原糖的游离羰游离羰基基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。发生氧化还原反应，而进行糖的测定。三、测定糖常用方法三、测定糖常用方法1 1、兰爱农（、兰爱农（Lane-Eynon）法）法 本方法又称本方法又称次甲基蓝法次甲基蓝法、置换法置换法、直接滴定法直接滴定法 用次甲基蓝作为指示剂，直接用用次甲基蓝作为指示剂，直接用还原糖还原糖滴定到滴定到斐林试剂斐林试剂中进行测定的方法。中进行测定的方法。OCuOHCH(CHOH) CO

4、OHCOONa CHOH CHOHCOOK O2HOHCH(CHOH) CHOCuCOONa CHO CHOCOOK 22n22n红色红色 由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量部还原后，过量1滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失！消失！OHCH(CHOH) CHO2nH2OCOOH(CHOH)4CH2OH+SHNN(H3C)2N+(CH3)2 HCl无 色OHCH(CHOH)CHOOH2nHCL蓝色蓝色无色无色多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定。多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定。如淀粉，可用酸解

5、或酶解。如淀粉，可用酸解或酶解。2 2、斐林试剂快速法（、斐林试剂快速法（GBGB法）：法）： 在斐林试剂中加入在斐林试剂中加入亚铁氰化钾亚铁氰化钾（黄血（黄血盐）。红色的盐）。红色的氧化亚铜氧化亚铜沉淀与沉淀与亚铁氰化钾亚铁氰化钾络合生成可溶性的复盐，反应终点为蓝色络合生成可溶性的复盐，反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。消失，淡黄色出现。2KOHFe(CN)CuKOHFe(CN)KOCu6222642 本方法是在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，本方法是在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显，

6、反应终点比兰爱农法更为明显。滴定终点明显，反应终点比兰爱农法更为明显。本本法是国家标准分析方法。法是国家标准分析方法。3 3、次碘酸钠法、次碘酸钠法4 4、铜试剂法、铜试剂法第二节第二节 蛋白质和氨基酸的蛋白质和氨基酸的化学检测化学检测 蛋白质是复杂的含氮有机蛋白质是复杂的含氮有机化合化合物，所物，所含的主要化学元素为含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些在某些蛋白质中还含有微量的蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元等元素，但素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志物的主要标志。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方

7、式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。 一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为16%16%，即一份氮素相，即一份氮素相当于当于6.256.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.256.25）称为）称为蛋蛋白质系数白质系数。 含氮量含氮量 每克每克N相当蛋白质相当蛋白质肉、蛋、豆肉、蛋、豆 16 6.25 面粉面粉 17.6 5.70 奶品奶品 15.7 6.38 花生花生 18.2 5.50 鲑精蛋白鲑精蛋白 31.5 3.171.1. 蛋白质含有多个蛋白质含有多个肽键肽键，因此可用，因此可用双缩脲试双缩脲试剂剂及由其发展而来的及由其发展而来的福林酚

8、试剂福林酚试剂进行蛋进行蛋白质的测定。白质的测定。2.2. 蛋白质的基本组成单位是氨基酸。通过蛋白质的基本组成单位是氨基酸。通过末末端氨基酸分析端氨基酸分析，则可弄清蛋白质中氨基酸，则可弄清蛋白质中氨基酸的种类和排列顺序。的种类和排列顺序。一、定氮法测定蛋白质的含量一、定氮法测定蛋白质的含量 凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（经经典的，仲裁的典的，仲裁的）1. 1. 原原 理理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的化碳和水逸出，而样品中的有机氮有机

9、氮转化为转化为氨氨与与硫酸硫酸结合成结合成硫酸铵硫酸铵。然后加碱蒸馏，。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。出蛋白质的含量。蛋白质蛋白质n H2O浓浓 n R CH COOHNH2（1 1）+ H2SO4 (NH4)2SO4+ CO2 + SO2 + H2O R CH COOHNH2（2 2）（3 3） (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3+ Na2SO4+ 2H2O（4 4） 2NH3+ H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5 H2O（5 5）

10、(NH4)2B4O7 + 5 H2O + 2HCl2NH4Cl + 4H3BO3(1)消化：消化： 取一定量样品放进凯氏定氮瓶，加入取一定量样品放进凯氏定氮瓶，加入一定量一定量K2SO4 、 CuSO4、浓、浓H2SO4， 通通风厨内进行。消化结束，消化液全部移风厨内进行。消化结束，消化液全部移入入100mL容量瓶定容。容量瓶定容。消化消化 蒸馏蒸馏 滴定与计算滴定与计算2.2.操作要点操作要点A.A.硫酸钾硫酸钾的作用的作用 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快快有机物的分解，有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾

11、可提高反应温度其反应式如下：式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O+SO3一般纯硫酸的沸点在一般纯硫酸的沸点在340340左右，而添加硫酸钾后，左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到可使温度提高到400400以上，原因主要在于随着消化以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高浓度增大，故沸点升高。 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：又会引起已生成的铵盐发生热分解

12、而造成损失： （NH4）2SO4 NH3+ (NH4)HSO4 2(NH4)HSO4 2NH3+ 2SO3+ 2H2OB.B.硫酸铜的作用硫酸铜的作用 催化剂催化剂 此反应不断进行，待有机物被消化完此反应不断进行，待有机物被消化完后，后，不再有硫酸亚铜不再有硫酸亚铜（褐色）（褐色）生成，溶液呈现清生成，溶液呈现清澈澈的蓝的蓝绿色。绿色。 可以指示可以指示消化消化终点的到达终点的到达。 C+ 2CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+22SO4 2CuSO4 +SO2+2H2O（2 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收（2 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收接收瓶内加入接收瓶内加入2%2%硼酸硼酸

13、溶液溶液10ml 10ml 及及混合指示液混合指示液1 1滴，并使滴，并使冷凝管的下端插入液面下；冷凝管的下端插入液面下；准确准确吸取吸取10.0ml10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以并以10ml10ml水洗涤水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。的棒状玻塞。将将10ml 40%10ml 40%氢氧化钠氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。防漏气。蒸馏蒸馏5min5min，

14、移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏馏1min1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。（3 3）滴定）滴定 全部蒸馏完毕后，用全部蒸馏完毕后，用0.0100N0.0100N标准盐酸标准盐酸溶液滴溶液滴定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混指示剂混合液由合液由绿色绿色变成变成淡紫红色淡紫红色，即为滴定终点。，即为滴定终点。（4 4）计算）计算蛋白质含量样品的总氮量蛋白质含量样品的总氮量6.256.25a14cB)A()mg(样品中的总氮量3 3、自动凯氏定氮法、自动凯氏定氮法（1）消化装置

15、用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消分钟可消化完毕。化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。二、双缩脲试剂法测定蛋白质二、双缩脲试剂法测定蛋白质 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双双缩脲反应缩脲反应。 蛋白质（多肽）蛋白质（多肽）CuSOCuSO4

16、4、NaOHNaOH 紫红紫红色化合物（铜钠双缩脲络合物）色化合物（铜钠双缩脲络合物） 颜色深浅与蛋白质含量成正比，与蛋白颜色深浅与蛋白质含量成正比，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。质的分子量和氨基酸组成无关。三、三、 福林酚试剂法测定蛋白福林酚试剂法测定蛋白质含量质含量 双缩脲法的发展，灵敏双缩脲法的发展，灵敏100100倍，需时较长，倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。大，酚类和柠檬酸也有干扰。 碱性铜试剂碱性铜试剂双缩脲反应双缩脲反应 稀释的苯酚试剂稀释的苯酚试剂与酪氨酸、色氨酸等与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应

17、呈蓝色芳香族氨基酸反应呈蓝色 两种呈色反应可叠加两种呈色反应可叠加四、氨基酸的测定四、氨基酸的测定 （一）茚三酮比色法 1. 原理 氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成蓝蓝紫色化合物紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反应物的吸光度（570nm）可计算出样品中氨基酸含量。2. 2. 试剂试剂 2%2%茚三酮茚三酮 pH8.04pH8.04磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液 氨基酸标准溶液氨基酸标准溶液3. 3. 仪器仪器 分光光度计 蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。

18、（二）氨基酸自动分析仪法 操作： （1）双缩脲试剂的配制 CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI (2) 标准曲线的制作1标准酪蛋白(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0双缩脲试剂 (mL) 4 4 4 4 4 4室温反应30min测A540 (3)样品测定 1mL4mL双缩脲试剂 ，30min，测A540 操作： （1）福林酚试剂的配制 甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3, B、CuSO4和酒石酸钾钠) 乙液：稀释的苯酚试剂 （2）标准蛋白溶液配制 结晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测

19、定含量） （3）标准曲线制作 （4）样品测定 1mL样品（含P15500 g）5mL甲液，室温10min，乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500750蛋白质的免疫化学检测 概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应 检测方法： （1）凝集反应 效价测定，细菌、病毒分类 （2）沉淀反应 沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等氨基酸含量测定方法 1 茚三酮显色法 微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物 取1mL样品溶液（含氨基酸0.150ug)加1mL缓冲液（pH5.06.7），再加

20、1mL茚三酮显色液，100 水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD4402 甲醛滴定法测定氨基酸 氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。 加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。 注意：需用过量中性甲醛。三 核酸的化学检测 根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。 1 定磷法测定核酸含量 （1）核酸的消化 （2）磷的测定 定磷试剂，45 水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线 （3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5,RNA含磷9.2，RNA量（总磷量无机磷量

21、）10.9DNA量 （总磷量无机磷量）10.52 二苯胺法测定DNA含量 DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40400 g范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。 （1）二苯胺试剂的配制 （2）标准曲线制作 （3）样品DNA含量测定3 地衣酚法测定RNA含量 核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。 操作： 地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定思考题 1 如何区别还原

22、糖与非还原糖？举出常见的还原糖与非还原糖。 2 有哪些定糖方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。 3 如何测定薯类淀粉含量？ 4 蛋白质含量测定有哪些方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。 5 如何用滴定法测定氨基酸含量？ 7如何用定磷法测定DNA或RNA含量？ 8 二苯胺测定DNA和地衣酚测定RNA原理？ 9 三瓶未知液分别为蛋白质、糖和RNA，如何鉴定？2 碘量法 I2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应 操作要点： （1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。 （2）标

23、准碘液配制，0.1mol/L （3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘 碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0 (4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液， V1 (5) 计算： 醛糖含量 （V0 V1）C M n 注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘） 配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）3 铜试剂法 将还原糖

24、与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。 （1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘 （2）标准曲线的制作 （a)标准葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根据所用铜离子试剂定） （b)三角瓶编号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL ) 5 4 3 2 1 0 铜试剂（mL ) 5 5 5 5 5 5 沸水浴10min，冷却至室温 （c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V (d) 绘标准曲线 葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（

25、V0-V)为横坐标操作要点 （1 ）斐林试剂的标定 （a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。 （b）标定 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0 (2) 定糖 （a）定糖预备试验 A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用

26、标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。 （b）定糖 A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V (3) 计算 还原糖含量（以葡萄糖计） （V0-V) c (1/10 )n 注意： （a）AB分开储存，防止Cu2+变化，临用混合 （b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净 （c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响 （d）煮沸时间要一致 （e）注意指示剂加入时间和加入量一致 （f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成） （g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热。 4. 测定方法 （1）样品处理 称样加水、活性炭加热提取过滤滤液定容 （2）标准曲线制备与样品测定标准溶液(200g/mL)样液标准或样液体积,ml0.00.51.01.52.02.52.0加入25mL比色管，加水至4.0ml加1mL茚三酮水浴加热15min迅速冷却，定容至25mL，静置15min测定吸光度（570nm)0A1A2A3A4A5Ai5. 5. 结果计算结果计算