中药指纹图谱研究技术课件.ppt

1、中药指纹图谱中药指纹图谱研究技术研究技术中华中医药学会中药化学分会委员周玉新一、中药指纹图谱技术概述一、中药指纹图谱技术概述二、中药指纹图谱研究指导原则二、中药指纹图谱研究指导原则三、指纹图谱研究的相似度计算三、指纹图谱研究的相似度计算四、中药指纹图谱的研究方法与思路四、中药指纹图谱的研究方法与思路五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）指指 纹纹 图图 谱谱 稳稳 定定 性性可可 控控 性性安安 全全 性性 有有 效效 性性 1. 中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系l植物学方法：植物学方法： 原植物鉴定，显微鉴定等

2、原植物鉴定，显微鉴定等l植物化学方法：植物化学方法： 理化鉴定理化鉴定l分析化学方法：分析化学方法： 仪器分析，色谱分析等仪器分析，色谱分析等l药理学方法：药理学方法： 生物鉴定法，生物等效等生物鉴定法，生物等效等l分子生物学方法分子生物学方法: DNA指纹鉴定指纹鉴定3. 国外植物药质量评价概况国外植物药质量评价概况标准制剂标准制剂：银杏银杏 人参人参 西洋参西洋参 五味子五味子甘草甘草 黄芪黄芪 贯叶连翘贯叶连翘定量测定结合主成分比例定量测定结合主成分比例固定产地以生产质量恒定制剂固定产地以生产质量恒定制剂多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹

3、图谱4. 中药指纹图谱的意义中药指纹图谱的意义 是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳定性定性 有利于中药及其产品进入国际市场有利于中药及其产品进入国际市场5. 中药指纹图谱建立的原则中药指纹图谱建立的原则 系统性： 指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位 所含大部成分的种类，或指标成分的全部 特征性： 指纹图谱中反映

4、的化学成分信息（具体 表现为保留 时间或位移值）是具有高度选择性的，是这些信息 的综合结果 稳定性： 指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致 的指纹图谱 色谱特征的稳定性： 特征峰 特征区 特征参数 色谱条件稳定性： 不同仪器的验证 不同实验室的验证 不同操作者的验证 品种鉴别-真伪 基源鉴别-产地 药用部位的鉴别-根、茎、叶、花、 果 提取工艺 药材炮制 限量成分的控制 一致性-不同批次的产品. 6. 指纹图谱研究目的指纹图谱研究目的 品种多、产地多;采收、加工不一致 化学组分与含量不同 （产品品质优劣不同） 有效组分种类繁多、含量相对少；非有效组分成 分复杂、含量高分析检测困难 （质

5、量控制指标不统一） 基础研究薄弱 药材GAP建设滞后7. 建立中药指纹谱所面临的问题建立中药指纹谱所面临的问题8. 对对 策策加强GAP药材种植基地建设加强中药种植与加工、炮制的规范化加强中药化学成分的基础研究 应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究 仪仪 器器 设设 备备 技技 术术 人人 员员 研研 究究 经经 验验9. 中药指纹谱研究过程中面临的问题中药指纹谱研究过程中面临的问题v 色谱法1. 液相色谱法（LC）2. 气相色谱法（GC）3. 薄层扫描法（TLC）4. 毛细管电泳法（CE）v 其它1. 质谱法（MS）及色谱与质谱联用2. X-衍射法3. 近红外法（NIR）等 应用范围应用

6、范围 仪器设备与软件仪器设备与软件 指纹图谱标准指纹图谱标准二、二、 中药指纹图谱研究指导原则中药指纹图谱研究指导原则（一）目的和要求（一）目的和要求（二）中药指纹图谱标准起草说明（二）中药指纹图谱标准起草说明（三）中药指纹图谱标准的建立（三）中药指纹图谱标准的建立中药质量研究和质量标准的一个重要内容中药质量研究和质量标准的一个重要内容加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控效、稳定、可控固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，需制定原料药需制定原料药(中药材中药材

7、)和注射剂的指纹图谱和注射剂的指纹图谱（一）目的和要求（一）目的和要求（二）中药指纹图谱标准起草说明（二）中药指纹图谱标准起草说明1. 名称、汉语拼音名称、汉语拼音2. 来源（产地、采收期、炮制）来源（产地、采收期、炮制） 按中药的命名原则制定按中药的命名原则制定药药 材：产地、采收期、炮制材：产地、采收期、炮制中间体：提取工艺或提取物的来源中间体：提取工艺或提取物的来源3. 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 有效成分有效成分(专属性成分、指标性成分专属性成分、指标性成分)的理化性投的理化性投 质并结合检测方法的要求质并结合检测方法的要求 提取工艺提取工艺4.参照物溶液的制备参照物溶液的制备

8、对照品对照品 内标物内标物 标准提取物标准提取物 5.中药指纹图谱检测方法的验证中药指纹图谱检测方法的验证 （1）检测方法）检测方法 测定方法、测定方法、 仪器仪器 、 试剂试剂 、 测定条件测定条件 （2） 验证验证 专属性专属性 （空白试验）（空白试验） 精密度试验（精密度试验（RSD3%） 重复性与重现性试验（重复性与重现性试验（S0.95） 稳定性试验（稳定性试验（S0.95） 系统适应性试验系统适应性试验6. 指纹图谱的相关性指纹图谱的相关性（三）中药指纹图谱标准的建立（三）中药指纹图谱标准的建立1.注意事项注意事项 （1）所有成分应在）所有成分应在2小时左右洗脱，并提供小时左右洗脱

9、，并提供2小时的指纹图谱小时的指纹图谱 （2）可建立各个组分的指纹图谱）可建立各个组分的指纹图谱 （3）可建立多种方法的指纹图谱）可建立多种方法的指纹图谱 （4）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱，）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱， 或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱2. 指纹图谱标准的建立指纹图谱标准的建立 （1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入 起草说明起草说明 （2）10批供试品批供试品 （3）标准的规定：）标准的规定：供试品的指纹图谱与

10、对照提取物（标供试品的指纹图谱与对照提取物（标准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。3.指纹图谱标准书写格式指纹图谱标准书写格式液相色谱法液相色谱法 【指纹图谱】【指纹图谱】 照高效液色谱法（中国药典一部附录照高效液色谱法（中国药典一部附

11、录VI DVI D），结），结合指纹图谱的要求测定。合指纹图谱的要求测定。 色谱条件及系统适用性试验色谱条件及系统适用性试验 如以对照品做系统适用性试验，如以对照品做系统适用性试验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。 对照品溶液的制备对照品溶液的制备 如有对照品则照中国药典书写格式。如有对照品则照中国药典书写格式。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对精密吸取供

12、试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各照用提取物溶液）各 XX XX m ml l，分别流入液相色谱仪，测定。，分别流入液相色谱仪，测定。 本品指纹图谱的主要特征本品指纹图谱的主要特征 供试品指纹图谱与质量标准所附的供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相似度大于似度大于 XXXX，符合要求（或相似度小于，符合要求（或相似度小于 XXXX，不符合要求）。，不符合要求）。三、指纹图谱研究的相似度计算三、指纹图谱研究的相似度计算（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法（一）、指纹图谱相似度评

13、价原则与方法（二）、指纹图谱相似度计算原理（二）、指纹图谱相似度计算原理（三）、指纹图谱相似度评价软件（三）、指纹图谱相似度评价软件（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法原则：原则： 整体性、模糊性、特征性整体性、模糊性、特征性方法：方法： 直接观察、计算机辅助相似性计算直接观察、计算机辅助相似性计算1. 1. 引用参数引用参数2. 2. 数据获取途径数据获取途径3. 3. 相似度算法相似度算法（二）、指纹图谱相似度计算原理（二）、指纹图谱相似度计算原理1. 1. 引引 用用 参参 数数 保留时间保留时间(RT)(RT) 峰高峰高(Height)(Height

14、) 峰面积峰面积(Area)(Area) 峰面积百分比（峰面积百分比（Area%Area%） 相对保留时间（相对保留时间（Ratio of Retention Time, RRatio of Retention Time, RRtRt） 积分相对比值（积分相对比值（Ratio of Area, RRatio of Area, RA A）2. 2. 数数 据据 获获 取取 途途 径径（1 1）图形）图形/ /图像转化成图像转化成ASCIIASCII数据数据（2 2）截片数据）截片数据（3 3）色谱数据）色谱数据 3. 3. 相相 似似 度度 算算 法法夹角余弦算法夹角余弦算法相关系数算法相关系数

15、算法优优 化化 算算 法法1. 1. 软件开发原则软件开发原则2. 2. 市售市售/ /常用软件简介常用软件简介3. 3. 相似度软件使用过程中应注意的问题相似度软件使用过程中应注意的问题（三）、指纹图谱相似度评价软件（三）、指纹图谱相似度评价软件1. 1. 软软 件件 开开 发发 原原 则则(1)(1) 系统独立性系统独立性 (2) (2) 计算方法的科学性计算方法的科学性 (3) (3) 数据接口通用性数据接口通用性 (4) (4) 操作过程及应用的实用性操作过程及应用的实用性2. 2. 市售市售/ /常用软件简介常用软件简介(1) 浙江大学 陈一宇教授(2) 中南大学 梁逸增教授(3)

16、沈阳药科大学 毕开顺教授(4) 西北大学 李华教授(5) 二军大(6) Waters3. 3. 相似度软件使用过程中应注意的问题相似度软件使用过程中应注意的问题(1) 数据接口与数据类型(2) 数据的校正(3) 算法的选择四、中药指纹图谱的研究方法与思路四、中药指纹图谱的研究方法与思路（一）、研究方案设计（一）、研究方案设计（二）、样品的选择与收集（二）、样品的选择与收集（三）、供试品的制备（三）、供试品的制备（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路（五）、相似度值的研究与指纹特征（五）、相似度值的研究与指纹特征（一）、研究方案设计（一）、研究方案设计1.1. 资料

17、收集与整理资料收集与整理 文献、工艺资料、质量标准2.2. 方案的设计方案的设计 （1）研究对象-有效成分 （2）研究方法的选择-色谱法(HPLC GC TLC)及其它方法 （3）研究内容-根据技术要求的规定：包括“名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明”（二）、样品的选择与收集（二）、样品的选择与收集要求：10个批次 道地药材与GAP基地药材 典型性与代表性 离散样品的剔除（三）、供试品的制备（三）、供试品的制备依据： 有效组分的物理化学性质 生产或提取工艺 检测方法的需要（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路1. 高效液相色谱法 HPLC2. 气相色谱

18、法 GC（1） 检测波长的选择 （简）（2） 柱温的选择 （略）（3） 进样量 （简）（4） 色谱柱的选择 （重点）（5） 检测成分的选择 （重点）（6） 流动相（梯度表）的选择 （重点） 1. 高 效 液 相 色 谱 法 HPLC 示例：蜂胶示例：蜂胶(Bee Propolis)(Bee Propolis)（1 1） 检测波长的选择检测波长的选择min10203040506070mAU0200400600800100012001400*DAD1, Sig=280.00, 2.00 Ref=off, EXT of HC012201.D = =280nm280nmmin1020304050607

19、0mAU0100200300400500*DAD1, Sig=360.00, 2.00 Ref=off, EXT of HC012201.D = =360nm360nmmin10203040506070mAU0100200300400500600700*DAD1, Sig=254.00, 2.00 Ref=off, EXT of HC012201.Dmin10203040506070mAU-2500-2000-1500-1000-5000*DAD1, Sig=210.00, 2.00 Ref=off, EXT of HC012201.D = =254nm254nm = =210nm210nmm

20、in10203040506070mAU0200400600800100012001400*DAD1, Sig=280.00, 2.00 Ref=off, EXT of HC012201.D波长选择： = =280nm280nm（4） 色谱柱的选择 选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：Eka-Nobel的的Kromasi C18 (5m mm)，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的Kromasi色谱柱，还是国外公司填充的色谱柱，还是国外公司填充的Kromasi色谱柱，在分离效果上基色谱柱，在分离效果

21、上基本相同。因此对于大多数中药注射剂，可选用本相同。因此对于大多数中药注射剂，可选用Kromasi色谱柱。色谱柱。 如选用乙腈如选用乙腈-缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱： 如为酸性缓冲溶液，可选用如为酸性缓冲溶液，可选用Zorbax SB-C18色谱柱（色谱柱（pH6）。）。 示例：不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果min010203040506070mAU 0100200300400500600 VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112501.D)LichosorbLichosorbmin01

22、02030405060mAU 0100200300400500 VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112502.D)PolarisPolarismin010203040506070mAU 0100200300400500600700 VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112500.D)KromasilKromasilmin0102030405060mAU 0100200300400500600700800 VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112503.D)DiamonsilDiamonsil

23、min01020304050mAU 0100200300400500600 VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112504.D)Carbosorb ODS-3Carbosorbmin010203040506070mAU 020406080100120140*VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112503.D)*VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112500.D)*VWD1 A, Wavelength=203 nm (SANQIA2112502.D)（5） 检测成分的选择 （重点）示例：何首乌m

24、in01020304050mAU 05001000150020002500 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFPA3091301.D) 2.143 2.333 2.699 2.828 4.141 10.608 11.127 11.847 12.179 12.631 12.897 13.069 13.402 13.922 14.207 14.522 14.685 14.869 15.094 15.553 15.925 16.343 16.761 16.946 17.210 17.662 18.131 18.539 18.884 19.348 19.540 19.816

25、 20.214 20.612 21.162 21.560 22.333 22.917 23.266 23.505 23.888 24.098 24.423 24.770 25.265 25.834 26.557 26.974 27.123 27.503 28.279 28.920 29.201 29.459 30.110 31.025 31.390 35.202 46.831 50.949 51.696何首乌生品的液相色谱图（全局图）min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFPA3091301.D) 11.127

26、 15.553 17.662 18.884 20.214 21.560 22.333 25.834 31.390 46.831 51.696何首乌生品的液相色谱图（局部放大图）min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091311.D) 14.058 14.834 16.045 17.349 17.766 18.544 18.977 20.756 21.153 22.004 23.427 24.203 25.501 26.196 31.120 35.252 46.625min01020304050mAU

27、050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091307.D) 17.693 18.916 21.606 31.361 35.241 46.864 51.745min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091308.D) 15.019 17.523 18.739 20.968 21.360 22.156 26.357 31.211 35.192 46.684 51.544min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wav

28、elength=296 nm (HSWFP1A3091314.D) 10.132 13.307 14.715 15.897 17.212 17.570 18.404 18.815 21.007 23.245 25.999 30.970 46.551 51.398min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091315.D) 10.139 11.521 14.021 14.715 15.298 15.878 17.207 17.546 18.396 18.802 20.012 20.992 25.985 30

29、.984 46.542 51.388min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091316.D) 10.181 11.537 14.036 14.733 15.325 17.222 18.411 18.811 20.026 20.995 25.977 30.976 46.540 51.374min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091317.D) 10.156 11.521 14.712 15.891 17.21

30、6 17.555 18.401 18.793 20.034 21.008 26.016 31.012 46.543 51.369min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091318.D) 2.509 2.761 10.214 11.542 13.224 14.049 15.339 15.914 17.225 17.567 18.403 18.797 20.037 20.597 21.004 21.872 23.242 26.007 31.007 46.530 51.357min01020304050mA

31、U 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091319.D) 2.508 2.761 10.178 11.525 12.645 13.231 14.044 14.318 14.720 15.092 15.329 15.911 16.385 16.907 17.235 17.568 18.415 18.795 19.249 19.892 20.061 20.608 21.016 21.885 23.239 23.630 24.075 30.992 46.607 51.553min01020304050mAU 050100150200 VW

32、D1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091321.D) 2.539 2.783 10.438 11.114 11.734 12.825 13.483 13.944 14.494 14.983 15.314 16.171 16.672 17.155 17.556 17.954 18.783 19.264 20.383 21.079 21.495 22.363 23.455 23.843 24.498 25.869 26.628 31.229 46.831 51.756min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=

33、296 nm (HSWFP1A3091322.D) 2.578 2.810 10.675 11.211 11.951 13.058 13.860 14.306 14.719 15.280 15.807 16.091 16.450 17.028 17.416 17.885 18.226 19.115 19.768 20.446 20.613 21.417 21.821 23.713 24.188 26.832 31.307 46.896 51.830min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091323.D

34、) 2.594 2.819 10.715 11.245 11.994 13.106 13.643 13.925 14.741 15.318 15.842 16.165 16.594 17.057 17.433 17.925 18.251 18.722 19.161 19.641 19.871 20.474 20.644 21.482 21.887 23.758 24.268 46.964 51.876min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091324.D) 16.560 17.923 19.152 1

35、9.653 19.880 21.468 21.866 23.717 24.275 31.417 47.053 52.010图图9 上海制首乌指纹图谱上海制首乌指纹图谱 min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091327.D) 16.002 17.172 18.126 19.373 20.222 22.110 22.748 24.486 46.919北京良方药业制首乌北京良方药业制首乌 min01020304050mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (H

36、SWFP1A3091329.D) 4.195 10.644 11.938 12.327 12.747 13.043 13.951 14.213 14.421 14.878 15.081 15.397 15.824 16.164 16.805 17.315 17.691 17.981 18.321 18.601 18.998 19.435 19.799 19.945 20.534 20.844 21.362 21.774 22.525 23.330 23.759 24.706 26.676 27.765 31.447 47.074北京金象药店制首乌北京金象药店制首乌 min01020304050

37、mAU 050100150200 VWD1 A, Wavelength=296 nm (HSWFP1A3091336.D) 2.833 10.609 11.226 11.500 11.903 13.918 21.694北京寿春堂药店制首乌指纹图谱北京寿春堂药店制首乌指纹图谱 （6） 流动相（梯度表）的选择主要影响因素 1. 起始浓度 2. 梯度速率 3. 流速时间时间min水水%（H+/OH-）*乙腈乙腈%* 01000552080600100 01000407030606040 08020406040605050 06040403070600100 指纹图谱流动相梯度优化指纹图谱流动相梯度优

38、化* 为体积百分比（为体积百分比（V/V） 梯梯 度度 表表初始色谱条件时间（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100时间（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100初始色谱条件的设定依据及目的1. 依据：化合物极性大小。如未知时，假设有效组分中包含各种极性的成分。2. 目的：快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相的组成，为优化条件的选择提供依据。优化条件的选择选择依据：初始色谱图、梯度洗脱表及一定的经验示 例：（1）淫羊藿总黄酮（40%）提取物（2）钩藤总生物碱（3）黄连药材（4）知母总皂苷min01020304050mAU 05001000150

39、0200025003000 VWD1 A, Wavelength=272 nm (ZZZA2071124.D)淫羊藿提取物在初始条件下的色谱图min01020304050mAU 05001000150020002500 VWD1 A, Wavelength=272 nm (ZZZA2071126.D)淫羊藿提取物第一次优化后的色谱图梯度速率：初始：100/60min=1.7 /min优化：01.7CH3CN%CH3CN%MinMin初始条件CH3CN%Min三七 人参 西洋参CH3CN%Min起始浓度： 根据初始色谱图中主要色谱峰被 洗脱时的流动相组成，相应减少 20%。流 速： 0.52.0

40、 ml/min2. 气 相 色 谱 法（1）影响色谱峰分离程度的因素色谱柱的类型载气流速起始柱温升温速率（2）研究示例样品：广藿香油指纹图谱研究过程方案设计1.1.检测方法检测方法（1 1）色谱方法）色谱方法广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到的挥发油，均为易挥发组分，拟采用气相色谱法（GC）。（2 2）仪器：）仪器：Agilent 6890 GC（3 3）色谱柱的选择）色谱柱的选择 可供选择的色谱柱：极性非极性 中等极性（4 4）进样方式的确定）进样方式的确定 手动 自动 顶空2. 2. 供试品溶液的制备供试品溶液的制备取广藿香油适量，加醋酸乙酯溶解，即得。注：对于非极性毛细管色谱柱，如供

41、试品溶液中含少量的少，最好干燥后进样。2. 2. 色谱条件的摸索色谱条件的摸索（1 1）对梯度速率及流速进行微调）对梯度速率及流速进行微调- -由粗到精由粗到精 min246810121416pA0200040006000800010000 FID1 A, (GHX_TESTC3091300.D)初始条件流 速：3.0 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：30/min min24681012141618pA01000200030004000500060007000 FID1 A, (GHX_TESTC3091301.D)第一次优化流 速：2.0 m

42、l/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：20/min 第二次优化流 速：1.0 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：10/min min510152025pA5001000150020002500 FID1 A, (GHX_TESTC3091302.D)第三次优化流 速：1.0 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：5/min min51015202530pA250500750100012501500175020002250 FID1 A, (GHX_TESTC30

43、91303.D)第四次优化流 速：0.5 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：5/min min5101520253035pA200400600800100012001400 FID1 A, (GHX_TESTC3091304.D)（2）选择细化的初始条件-由细到精 初始条件流 速：1.0 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：50升温 速 率：1.0/min min20406080100120140pA100200300400500600 FID1 A, (GHX_TESTC3091307.D)第一次优化流 速：1.0

44、ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：150升温 速 率：1/min min5101520253035pA5001000150020002500 FID1 A, (GHX_TESTC3091309.D)（3 3）根据初始条件（由粗到精）下的色谱图，计算）根据初始条件（由粗到精）下的色谱图，计算 大多数色谱峰出峰时的柱温范围，确定第一次大多数色谱峰出峰时的柱温范围，确定第一次 优化时柱温的梯度变化范围。优化时柱温的梯度变化范围。 初始条件min246810121416pA0200040006000800010000 FID1 A, (GHX_TESTC3091300.D

45、)结果：RT=7min后，基本没有色谱峰；RT=8min后，基线平直。主要色谱峰被洗脱时的RT：4min7min主要色谱峰被洗脱时的柱温范围：170250 第一次优化流 速：1.0 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：100升温 速 率：5/min min5101520pA100200300400500600700800900 FID1 A, (GHX_TESTC3091305.D)第二次优化流 速：0.5 ml/min进样口温度：250检测口温度：280初 始 柱 温：100升温 速 率：5/min min5101520253035pA20040060080010

46、00 FID1 A, (GHX_TESTC3091306.D)结结 论论对本供试品中的组分的分离，升温速率是主要影响因素，载气（N2）的流速是次要因素。本供试品中的挥发性组分，其沸点相对较高，故应相应提高初始柱温的设置值。载气（N2）的流速的调整可改善色谱峰的分离。 注意的问题注意的问题条件优化的目的：应尽可能使每个色谱峰为单一色谱峰保证大多数峰及/或含量较高的成分达到基线分离。初始柱温的设置梯度变化的速率保留时间 最佳30min溶剂空白 1.1.注意的问题注意的问题溶剂色谱峰溶剂色谱峰-色谱纯试剂色谱纯试剂杂质（敷料）色谱峰杂质（敷料）色谱峰-分离提取分离提取2.2. 相似度值的计算相似度值的计算3. 3. 指纹特征指纹特征特征指纹峰与特征指纹区特征指纹峰与特征指纹区（五）、相似度值的研究与指纹特征（五）、相似度值的研究与指纹特征指纹图谱研究过程中的复杂样品的选择有效组分的复方制剂西洋参与淫羊藿