自噬研究的相关知识课件.ppt

1、二、自噬溶酶体系统二、自噬溶酶体系统 自噬（自噬（autophagy）性细胞死亡）性细胞死亡, 是是凋亡和坏死之外的第三种程序性细之外的第三种程序性细胞死亡方式胞死亡方式. 自噬是真核生物进化过程中高度保守一类降解途径，通过自噬是真核生物进化过程中高度保守一类降解途径，通过形成双层膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器（线形成双层膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分子，粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。实现循环再利用。 自噬体的半衰期自噬体的半衰期 8 min8 min左右，是细胞对于环境变化的有效反应

2、。左右，是细胞对于环境变化的有效反应。细胞自噬的分类细胞自噬的分类1 1、巨型细胞自噬、巨型细胞自噬 (macroautophagy)，又称为，又称为大自噬大自噬，是指细胞内，是指细胞内新生新生的球状脂质双层的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞器，并运送到溶酶体降解的自噬行包裹胞浆蛋白和细胞器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。为。2 2、微型细胞自噬、微型细胞自噬 (microautophagy)，又称为，又称为小自噬小自噬，是指通过，是指通过溶酶溶酶体膜体膜的内陷、突起和的内陷、突起和/ /或分隔，直接吞入细胞浆的自噬行为。或分隔，直接吞入细胞浆的自噬行为。3 3、分子伴侣介导的细胞自噬、分子伴侣

3、介导的细胞自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)，是指，是指由由分子伴侣分子伴侣将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同AutophagyAutophagy is a cellular degradation system in which cytoplasmic components, including organelles, long-life protein are sequestered by double-

4、membrane structures called autophagosomes and the sequestered materials are degraded by lysosomal hydrolases ControlStarvation基础自噬：基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬过程过程, 对细胞内物质的更新及细胞内环境稳态的维持具有不可或缺的作用对细胞内物质的更新及细胞内环境稳态的维持具有不可或缺的作用。诱导自噬：诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺少营养物质或能量是细胞应对外界刺激的一

5、种保护反应。缺少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下、受到氧胁迫等情况下, 细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。过程。 如哺乳动物出生后初期如哺乳动物出生后初期, 由于母体不再提供营养来源由于母体不再提供营养来源, 幼体的细胞自噬非常活跃幼体的细胞自噬非常活跃, 这为这为维持其生命活动起了非常重要的作用。维持其生命活动起了非常重要的作用。基础自噬和诱导自噬基础自噬和诱导自噬自噬进程自噬进程1 1、自噬的诱导激活、自噬的诱导激活2 2、自噬体的成核和延伸、自噬体的成核和延伸3 3、自噬体与溶酶体融合、自噬体与溶酶体融合4 4、内容物降解、内容物

6、降解第一步：第一步：自噬的诱导自噬的诱导 一系列自噬相关基因（一系列自噬相关基因（autophagy-related geneautophagy-related gene，AtgAtg）组成的复合体）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是参与调控自噬体的形成。主要是 Atg1/ULK1 Atg1/ULK1 复合体复合体，包括，包括Atg1Atg1、Atg13Atg13、Atg17, mTORC1 Atg17, mTORC1 磷酸化磷酸化Atg1/ULK1Atg1/ULK1和和Atg13Atg13抑制自噬的起始。抑制自噬的起始。mTORC1mTORC1失活失活自噬激活自噬激活ULK1 ULK1

7、 去磷酸化去磷酸化Atg7 -Atg3-inductioninduction第二步：第二步：自噬体的成核，自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样结构结构: :分离膜分离膜(isolation membrane，IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体前自噬体(pre-autophagosome PAS) ，是自噬发生的标志之一。需要，是自噬发生的标志之一。需要Atg6Atg6（Beclin1Beclin1）-Class PI3K-Class PI3K 复合体复合体以及以及

8、Atg12-Atg5-Atg16LAtg12-Atg5-Atg16L复合体复合体. .形态特点：形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结构，两层膜之间有腔。自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内腔变得不明显。多种随着自噬前体增大和包裹内容物，内腔变得不明显。多种ATG ATG 蛋白参与自噬前体的蛋白参与自噬前体的组装。组装。组分来源：组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质网或高尔基复合体等来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质网或高尔基复合体等膜结构。膜结构。Atg7 -Atg3-inductioninducti

9、on第二步：第二步：自噬体膜的延伸，自噬体膜的延伸，自噬前体在两个类泛素系统作用下，包括自噬前体在两个类泛素系统作用下，包括Atg12-Atg5-Atg12-Atg5-Atg16LAtg16L复合体复合体和和LC3(Atg8) LC3(Atg8) 作用下，作用下，LC3LC3不断接受不断接受PEPE，扩展膜的长度，成为成熟的，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡闭合自噬泡。形态特点：形态特点：自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双层膜结构的圆形自噬泡，自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。内容物为不断捕获的待

10、降解的衰老的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。Atg7 -Atg3-第三步：第三步：自噬体与溶酶体的融合自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的生物膜融合，变成一被运送到溶酶体，两者的生物膜融合，变成一个自噬溶酶体个自噬溶酶体(atuolysosome)。形态特点：形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，在透射电镜下自噬溶多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。第四步：第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，成为降解性自噬体自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，成为降解性自噬体

11、(degradative autophagic vacuole)。 自噬的诱导自噬的诱导自噬体的成核自噬体的成核和延伸和延伸 自噬溶酶体的形自噬溶酶体的形成成内容物的降解内容物的降解自噬的调节自噬的调节1 1、mTORmTOR活性调节活性调节2 2、胰岛素（激活、胰岛素（激活mtormtor；抑制；抑制FoxO3FoxO3）自噬调控的中心分子自噬调控的中心分子TOR(target of rapamycin) 雷帕霉素作用的靶位点雷帕霉素作用的靶位点( T aget of rapamycin, TOR ) 是氨基酸、是氨基酸、A T P和激素的和激素的感受器感受器, 它在调节细胞生长和自噬的发生

12、过程它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。有重要作用。 TOR(target of rapamycin) 能感受细胞能感受细胞的多种变化信号的多种变化信号, 加强或降低自噬的发生水平。加强或降低自噬的发生水平。细胞内细胞内ATP水平、缺氧等细胞信号都可直接水平、缺氧等细胞信号都可直接或间接通过或间接通过TOR将其整合将其整合, 从而改变细胞的从而改变细胞的自噬发生自噬发生, 应对不同的外界环境刺激。应对不同的外界环境刺激。 Atg1是一种丝氨酸是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶苏氨酸蛋白激酶, 哺乳动物中同源哺乳动物中同源蛋白蛋白ULK1, ULK1以复合物的形式存在以复合物的形式存在, 除了

13、除了ULK1本身本身, 还还包括包括mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶一种与黏着斑激酶FAK相互作用的相互作用的蛋白蛋白)和和Atg101。Atg1/ULK1蛋白激酶复合体蛋白激酶复合体 当营养足够时当营养足够时, 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物物1( mTORC1)与与Atg1/ULK1 复合物与结合复合物与结合,通过通过磷酸化磷酸化Atg1/ULK1 和和ATG13 从而抑制自噬的起始从而抑制自噬的起始从而抑制自噬。从而抑制自噬。 在饥饿的条件下在饥饿的条件下, mTORC1 从从Atg1/ULK1 复复合物上分离合物上分离, 从而从而诱导自噬体的成核诱导

14、自噬体的成核(Nucleation)和和延伸延伸(Elongation)。AMPK是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶, 在自噬发生的调控中也发挥着重在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。低要的作用。低ATP水平状态下水平状态下(如饥饿或缺氧如饥饿或缺氧)AMPK能感受能感受AMP的水平变化而激活的水平变化而激活, 从而磷酸从而磷酸化结节性硬化复合体化结节性硬化复合体TSC2(tuberous sclerosis protein) 加强加强TSC1/2对对Rheb的抑制的抑制, 最终使最终使mTOR的活性被抑制的活性被抑制, 诱导细胞发生自噬。诱

15、导细胞发生自噬。AMPK(AMP-activated protein kinase)Atg9Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的AtgAtg基因基因, , 能通过能通过影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。营养物质缺乏营养物质缺乏时时, Atg9, Atg9与与Atg23Atg23、Atg27Atg27结合结合, , 将它们运将它们运输至输至PAS; PAS; Atg9/mAtg9在Atg5-Atg12-Atg16连接系统中, 首先由Atg7(E1)活化Atg12; 然后将Atg12传递给类Atg10（E2）最后, Atg1

16、2被传递到Atg5, 与Atg5的Lys共价结合形成Atg12-Atg5复合物。自噬发生时, Atg16和Atg12-Atg5结合，Atg16含有一个螺旋卷曲结构易于形成低聚物, 使得其能把更多的Atg12-Atg5连接起来形成巨大复合物。从而可能为参与自噬泡形成的蛋白质提供相互作用的平台。自噬发生时自噬发生时, 此复合此复合物定位于隔离膜上物定位于隔离膜上, 参与参与 LC3-II的形成过程的形成过程, 从而促进自噬从而促进自噬泡膜的延长。泡膜的延长。自噬发生过程中有两组类泛素化修饰类泛素化修饰过程, 分别发生在Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统中, 用于隔离

17、膜的延长和自噬泡的形成隔离膜的延长和自噬泡的形成。Atg5-Atg12-Atg16复合物复合物Atg8/LC3LC3：是酵母是酵母Atg8分子在哺乳动物中的同源物，是自噬发生的一个标志蛋白分子在哺乳动物中的同源物，是自噬发生的一个标志蛋白。功能：促进功能：促进自噬泡膜的延长和融合自噬泡膜的延长和融合, 是自噬泡形成所必需的。是自噬泡形成所必需的。 LC3合成后合成后, 最初以最初以pro-LC3形式存在形式存在, 然后立刻被然后立刻被Atg4B切割切割形成形成LC3-I。自噬发生时。自噬发生时, 均匀分布于细胞质中的均匀分布于细胞质中的LC3-I被被Atg7（E1）活化并与其形成硫酯键活化并与

18、其形成硫酯键, 然后被传递给然后被传递给Atg3（E2）, 并最并最终在终在Atg5-Atg12-Atg16复合物复合物（E3）的帮助下连接上一个的帮助下连接上一个PE分分子子, 形成具有膜结合能力的形成具有膜结合能力的LC3-II。Atg16L的细胞定位决定了的细胞定位决定了LC3成熟的位置成熟的位置, 并促进并促进LC3-II结合到自噬泡上。结合到自噬泡上。 自噬小泡的成核自噬小泡的成核需要含有需要含有ATG6(其哺乳动物同源蛋白命名为其哺乳动物同源蛋白命名为Beclin 1)的复合物的复合物, 这个复合物能够与第三类磷酸肌醇这个复合物能够与第三类磷酸肌醇3 激酶激酶VPS34 形成超级复

19、合物并使其激活产生磷形成超级复合物并使其激活产生磷脂酰肌醇脂酰肌醇3 磷酸。磷酸。PI3P可以组装一些含有可以组装一些含有PX和和FYVE结构域的蛋白质到早期自噬泡产生结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置的位置, 促使自噬前体的形成促使自噬前体的形成。ATG6/Beclin-1Vps34是哺乳动物中的第是哺乳动物中的第III类类PI3 K。在。在Vps34复合物中复合物中, Vps34因结合因结合Vps15而被激活而被激活, 并进并进一步结合一步结合Beclin1形成形成Vps34-Vps15-Beclin1复合体复合体。功能：功能：自噬发生时自噬发生时, Vps34-Vps15-Beclin

20、和和多种自噬相关蛋白结合多种自噬相关蛋白结合, 传递自噬信号促进自传递自噬信号促进自噬发生。噬发生。Vps34/PI3K-Beclin1复合物复合物1、 如与如与Atg14结合形成结合形成Atg14-Vps34-Vps15-Beclin1复合复合物参与自噬泡的形成物参与自噬泡的形成; 2、与、与VRAG结合形成结合形成VRAG-Vps34-Vps15-Beclin1在自噬在自噬泡成熟和运输中起作用。泡成熟和运输中起作用。3、 促进产生磷脂酰肌醇促进产生磷脂酰肌醇-3-磷酸磷酸(PI3P), PI3P可以组装一可以组装一些含有些含有PX和和FYVE结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置结构域的蛋白

21、质到早期自噬泡产生的位置, 促使自噬前体的形成。促使自噬前体的形成。自噬的分子机制自噬的分子机制v mTORC1：哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白复合物1v Atg12/LC3：两种泛素样加工系统，包裹自噬底物形成自噬体。v Atg12-Atg5-Atg16L1:与外膜结合，促进伸展v Atg5:决定膜伸展方向v LC3-：自噬体标志分子，判断诱导或抑制v Atg9:嵌膜蛋白来回循环移动活化该激酶复合物从而产生自噬分隔膜。v PE:磷脂酰乙醇胺Physiological and pathological roles of autophagy1 1、应激功能、应激功能 细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存

22、活机制。细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。 在营养充足条件下，自噬发生处于较低水平，仅在胞质中去除受损和多余在营养充足条件下，自噬发生处于较低水平，仅在胞质中去除受损和多余的细胞器以维持细胞内环境稳定，称为基本自噬。细胞营养缺失时，细胞立即启的细胞器以维持细胞内环境稳定，称为基本自噬。细胞营养缺失时，细胞立即启动自噬以维持胞质中氨基酸池的平衡，可通过合成新的蛋白质、能量生成和促进动自噬以维持胞质中氨基酸池的平衡，可通过合成新的蛋白质、能量生成和促进糖异生来避免细胞糖异生来避免细胞“饿死饿死”。自噬的生物学意义自噬的生物学意义2 2、防御功能、防御功能 在细胞受到致病微生物感染时，细胞自

23、噬起一定的防御作用。在细胞受到致病微生物感染时，细胞自噬起一定的防御作用。 某些细菌和病毒可逃离异噬途径，避免溶酶体某些细菌和病毒可逃离异噬途径，避免溶酶体消化。李斯特菌属、志贺杆菌属、立克次体属等的消化。李斯特菌属、志贺杆菌属、立克次体属等的细菌可通过降解异噬体膜逃入细胞质。细胞能够通过自噬发挥先天性细菌可通过降解异噬体膜逃入细胞质。细胞能够通过自噬发挥先天性免疫作用，抵抗细菌入侵。结核杆菌通常定居于异噬体内，但可激活免疫作用，抵抗细菌入侵。结核杆菌通常定居于异噬体内，但可激活自噬途径被溶酶体酶杀死。自噬途径被溶酶体酶杀死。 自噬也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫，还可以自噬也可

24、以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫，还可以将病毒抗原递呈给将病毒抗原递呈给 类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用。类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用。4 4、延长寿命、延长寿命 细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。 如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。 长期减少热量摄入，在一些物种能延长寿命。长期减少热量摄入，在一些物种能延长寿命。3 3、维持细胞稳态、维持细胞稳态 在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的“看

25、家看家”(house keeping)功能，帮助细胞浆成功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。分，包括线粒体，进行更新。自噬样细胞死亡（自噬样细胞死亡（autophagic cell death，ACD）：）： 在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂、细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等，被称为核破裂、细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样自噬样细胞死亡，细胞

26、死亡，它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的相应的，凋亡为凋亡为Type I cell death，坏死为坏死为Type III cell death。 尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是自噬引起死亡还是死亡时有自噬发生，但不是直接原因？争议。到底是自噬引起死亡还是死亡时有自噬发生，但不是直接原因？5 5、参与控制细胞死亡及癌症、参与控制细胞死亡及癌症 自噬在肿瘤发生中的双重作用，在多种人

27、类肿瘤中均存在自噬活性的自噬在肿瘤发生中的双重作用，在多种人类肿瘤中均存在自噬活性的改变。改变。一方面，自噬可抑制肿瘤的发生一方面，自噬可抑制肿瘤的发生: 首先，自噬可清除受损细胞器以避免有害的氧自由基蓄积及突变的发首先，自噬可清除受损细胞器以避免有害的氧自由基蓄积及突变的发生。生。 其次，自噬可限制其次，自噬可限制DNA 损伤，维持基因组完整性。在永生化鼠肾上皮损伤，维持基因组完整性。在永生化鼠肾上皮细胞中自噬活性降低可导致细胞细胞中自噬活性降低可导致细胞DNA 损伤，基因扩增，染色体非整倍性，损伤，基因扩增，染色体非整倍性，从而增加了致癌性突变率，促进了肿瘤的发生。从而增加了致癌性突变率，

28、促进了肿瘤的发生。 再次，自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。再次，自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。细胞自噬与肿瘤细胞自噬与肿瘤另一方面，另一方面，自噬通过限制细胞坏死和炎症促使肿瘤细胞存活于代谢性应自噬通过限制细胞坏死和炎症促使肿瘤细胞存活于代谢性应激的环境中，这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性能增强肿瘤对应激的适激的环境中，这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性能增强肿瘤对应激的适应性，应性，对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用。当快速。当快速生长的肿瘤细胞缺乏营养时，实体肿瘤内部血供不良，癌细胞利用自噬生长的肿瘤细胞缺乏营养时，

29、实体肿瘤内部血供不良，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的机制对抗营养缺乏和缺氧，通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养及能量，可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。生长提供营养及能量，可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。自噬检测技术自噬检测技术1 自噬性结构的电镜下形态学观察自噬性结构的电镜下形态学观察-电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构 电镜下可观察到双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体结构,其中包裹着未被完全降解的胞浆成分。初始自噬囊泡(Avi)降解自噬囊泡(AVd)缺点：电镜观察仅能证明自噬性

30、结证明自噬性结构的存在构的存在，难以反映自噬活性的强弱。2 基于自噬体标记蛋白基于自噬体标记蛋白LC3 的检测方法的检测方法 微管相关蛋白微管相关蛋白1 轻链轻链3(LC3), LC3-始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，的标记， 2.1 通过构建绿色荧光蛋白通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和和LC3的融合蛋白的融合蛋白,通过荧光显微镜就可观察通过荧光显微镜就可观察LC3在细胞中的定位。在细胞中的定位。 通过免疫荧光的方法检测内源性通过免疫荧光的方法检测内源性LC3或转染或转染GFP-LC3 融合

31、蛋白的表融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增理论上，观察到的点状聚聚集增理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。自噬的情况。可以从总体上大致反映自噬的增加或减少可以从总体上大致反映自噬的增加或减少 除了荧光显微镜观察除了荧光显微镜观察LC3外外,LC3还是生化方法检测自噬体的有利工具。内源性还是生化方法检测自噬体的有利工具。内源性LC3-II的量在某种程度上可反映细胞自噬活性。因此的量在某种程度上可反映细胞自噬活性。因此,通过免疫印记方法检

32、测通过免疫印记方法检测LC3-II信号的强弱来对哺乳动物细胞自噬活性进行定量检测。信号的强弱来对哺乳动物细胞自噬活性进行定量检测。 2.2 LC3-的水平在某种程度上反映了自噬体的多少的水平在某种程度上反映了自噬体的多少ControlStarvationX depletion promotes autophagy Si-XcontrolStarvation LC3p62-actinStarvation+-X Know downMock XNutrientLC3 GFP-LC3 切割切割LC3 连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶体降解，但连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶体降解，但GFP 在溶在溶酶

33、体中仅表现荧光信号猝灭，酶体中仅表现荧光信号猝灭，GFP 本身并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释本身并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的放出游离的GFP有鉴于此，通过免疫印迹的方法有鉴于此，通过免疫印迹的方法检测游离检测游离GFP 蛋白的出现即意蛋白的出现即意味着自噬性降解的发生味着自噬性降解的发生。GFP2.3 GFP-LC3剪切分析剪切分析3 基于自噬性降解的检测基于自噬性降解的检测 “自噬潮自噬潮”分析分析 自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。的

34、运送以及在溶酶体内降解的整个过程。3.1 长寿命蛋白降解长寿命蛋白降解 根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中生长一段时间酸的培养基中生长一段时间(数小时至数天数小时至数天)，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记，然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途素标记，然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解径降解 在自噬诱导后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可在自噬诱导

35、后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力。反映细胞自噬性降解的能力。优点：优点：较单纯自噬体检测更能反映自噬活性，较单纯自噬体检测更能反映自噬活性， “自噬潮自噬潮”分析是反映自噬活性分析是反映自噬活性的可靠指标的可靠指标。 自噬诱导后，融合表达自噬诱导后，融合表达GFP-LC3 蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体融合，溶酶体内的酸性环境可以导致融合，溶酶体内的酸性环境可以导致GFP 荧光信号的猝灭，红色荧光蛋白荧光信号的猝灭，红色荧光蛋白RFP 对酸性对酸性环境具有很好的耐受性借助于两种荧光蛋白的这种

36、差异，通过构建环境具有很好的耐受性借助于两种荧光蛋白的这种差异，通过构建RFP-GFP-LC3 串串联体联体，在自噬诱导后，可以观察到自噬体和自噬溶酶体分别成黄色和红色标记，如果，在自噬诱导后，可以观察到自噬体和自噬溶酶体分别成黄色和红色标记，如果自噬潮增加，两种颜色的点状聚集均增。如果自噬体向自噬溶酶体成熟步骤受阻，黄自噬潮增加，两种颜色的点状聚集均增。如果自噬体向自噬溶酶体成熟步骤受阻，黄色点状聚集增加，红色不增加色点状聚集增加，红色不增加优点：实现了自噬体向溶酶体转化步骤的监控。优点：实现了自噬体向溶酶体转化步骤的监控。不足：不能反映降解过程。不足：不能反映降解过程。3.2 RFP-GF

37、P-LC3 的溶酶体呈递的溶酶体呈递 通过通过 RNAi 干扰干扰 Atg3 Atg5 Atg7 及及 Beclin1等自噬相关基因的表达后，等自噬相关基因的表达后，细胞表现为自噬功能缺失，与工具药相比，通过基因沉默或敲除技术来抑细胞表现为自噬功能缺失，与工具药相比，通过基因沉默或敲除技术来抑制自噬具有相对强的特异性。制自噬具有相对强的特异性。4 RNAi 干扰干扰 体内自噬分析的策略有三种：体内自噬分析的策略有三种：一、传统的基于对组织切片标本进行电镜观察和一、传统的基于对组织切片标本进行电镜观察和 LC3 蛋白的检测。蛋白的检测。二、应用二、应用 GFP-LC3 转基因小鼠实现体内自噬的实

38、时监测。转基因小鼠实现体内自噬的实时监测。三、通过构建自噬相关基因缺失的实验动物，这为研究自噬在机体水平所发挥的作三、通过构建自噬相关基因缺失的实验动物，这为研究自噬在机体水平所发挥的作用并验证体外试验的结果提供了很好的平台用并验证体外试验的结果提供了很好的平台 ，实现体内自噬活性的实时监控，而，实现体内自噬活性的实时监控，而仅凭观察到的自噬体出现无法说明自噬活性的改变。仅凭观察到的自噬体出现无法说明自噬活性的改变。5 体内自噬分析体内自噬分析Vps34f/f MEFs 2011 Nadia Jaber PNAS2008 Gbor Juhsz JCBThe class III PI(3)K V

39、ps34 is essential for autophagy自噬的抑制根据自噬形成的过程，自噬的抑制分为不同的阶段：根据自噬形成的过程，自噬的抑制分为不同的阶段：（1 1）对自噬体形成的抑制：主要是）对自噬体形成的抑制：主要是PI3KPI3K通路的抑制剂，通路的抑制剂，3-MA, 3-MA, WortmanninWortmannin，LY294002LY294002等等（2 2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：有巴伐洛霉素）对自噬体与溶酶体融合的抑制：有巴伐洛霉素A1A1、长春碱、诺考、长春碱、诺考达唑等。达唑等。（3 3）对溶酶体降解的抑制）对溶酶体降解的抑制: :氯喹、蛋白酶抑制剂，如氯喹、蛋白酶抑制剂，如E64dE64d、Pepstatin Pepstatin A A等等JCBDFCP1自噬体系和蛋白酶体系自噬体系和蛋白酶体系 自噬与自噬与UPS之间在功能上有重叠之间在功能上有重叠-错误折叠蛋白错误折叠蛋白HSP70介导的自噬，HSP70底物可被泛素化 错误折叠蛋白的聚集体被巨自噬降解错误折叠蛋白的聚集体被巨自噬降解 神经元蛋白-突触核蛋白 自噬与自噬与UPS相互影响相互影响