RNAi技术及其应用共131页文档课件.ppt

1、现在几乎每天都会有文章对各种小RNA与机体发育之间关系的进展进行报道。而精明的生物技术公司也正在以惊人的速度积极地将RNAi的相关知识运用于药物筛选研究。借助现今先进的测序技术，人们鉴定出了多种新型小RNA，而随后，它们的强大功能将会继续吸引我们研究下去，相信研究结果一定会让我们感到惊喜。双链RNA能够以序列特异性的方式导致基因沉默的机制自发现起就对生物学的发展产生了巨大影响，它揭示了人们以前未曾注意到的基因表达调控机制。这种机制被称为RNA干扰（RNAi）或者RNA沉默（RNAsilencing）。其核心内容是：一些非编码小RNA分子（smallnon-codingRNA，2030nt）进入

2、细胞后与序列互补的信使RNA靶标配对，阻止其表达。2019年9月，自然首次刊登了美国科学家AndrewZ.Fire与llo等人撰写的关于RNA干扰的成果文章。时隔不久，RNAi技术取得了非凡的成就。人们逐渐意识到，RNAi将会对生物学的发展带来深远的影响。毫无疑问，打开了RNAi这一潘多拉盒子的AndrewFire与CraigMello获得了2006年的生理学或医学诺贝尔奖。诺贝尔委员会成员GoranHansson在该年的颁奖词中说道：“RNAi为我们了解生命提供了新视角，并为医学发展提供了新工具。”不过，RNAi的故事才刚刚开始，许多悬念有待人们逐个解开。细胞内表达的长dsRNA或外源性长d

3、sRNA（可以是由正链转录产物和负链转录产物配对而成的结构，也可以是ssRNA内形成的茎环结构）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合物（RISC）中；装载了小RNA的RISC复合物就会在细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA靶分子。被装载入RISC复合物当中的向导链（guidestrand）-ssRNA随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶（有时被称作“切割机”，现在人们知道它是Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的mRNA靶分子。向导链就是通过这种方式来发挥特异性的RNAi作用的；尽管不同生物体内，参与RNAi

4、途径的蛋白和相关机制各有不同，但是它们的干扰策略却惊人地一致。在所有被研究过的物种中，RNAi都包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA与其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基因组完整性，或产生一系列特异性的小RNA。随着高通量测序技术的出现以及生物信息学的不断进步，科研人员得以对小RNA的起源及其靶向机制开展更深入的研究。他们发现，在各个不同的物种当中，RNAi系统获得了不同程度的改

5、进，包括进化出“内置式的”分子“刻度尺”，用来控制小RNA的大小和结构，从而挑选出小dsRNA中最合适的那条单链分子进入下一步骤；或进化出防止“脱靶”现象出现的机制等等。科研人员还发现RNAi通路的活性会在各个水平（从小RNA的生成到RISC复合物的沉默模式）受到严密调控。各种不同的RNA沉默途径之间存在竞争关系，比如黑腹果蝇中的endo-siRNA和miRNA之间就相互竞争LOQS。这种竞争机制就是RNAi途径中决定每一个阶段里如何发生调控的关键步骤。很多植物和动物病毒都会编码抑制蛋白来抑制宿主细胞的RNAi途径，使得这些调控机制无法在各个不同阶段发挥正常作用。细胞的蛋白质同样也能够调控RN

6、Ai。比如，在人体胚胎细胞中，miRNAlet-7分子（一种抑癌分子，同时也是一种细胞周期调控分子）的生成过程就是一条转录后被抑制的过程，该途径被多潜能因子LIN28所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微处理器复合物中的剪切过程及后续由Dicer蛋白负责的pre-let-7前体分子的处理过程。不过，人体同时存在另一条路径。转化生长因子（TGF-）和生长因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促进miR-21这种促癌分子的生成。这是因为这些蛋白能够促进DROSHA将pri-miR-21转化成pre-miR-21。更确切地说，SMAD蛋白家族成员TGF-和BMP信号转换因子与RNA解

7、旋酶p68组成的复合物一起被招募至pri-miR-21，促进pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）这种著名的前体mRNA分子剪切调控因子也会帮助DROSHA发挥作用，有效地生成pre-miR-18，这可能是由hnRNPA1蛋白能够重新折叠发夹结构，或者直接与pri-miRNA结合，为DROSHA构建出一个酶切位点而造成的。这也说明在pri-miRNA分子中，某些发夹结构可能是在pri-miRNA分子与RNA伴侣蛋白结合之后才会形成并被剪切的。RISC复合体的活性同样能够被调控。在拟南芥中，非编码基因IPS

8、1中含有的一段基序能够与miR-399序列互补，但是它们之间的互补配对过程却被该miRNA分子中酶切位点处的一段错配形成的环状结构给破坏了。这样，IPS1基因的mRNA产物不仅没能被miR-399降解，反而还大量“扣押了”miR-399分子。因此，如果IPS1基因大量表达会使得胞内“积聚”大量miR-399分子的靶标-PHO2基因mRNA。这种靶标之间的相似性会给RNA调控网络带来不可预料的复杂性。我们预测，最近在人体细胞中发现的大量mRNA样非编码RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能会在小RNA-Argonaute蛋白复合体调控过程中起到“减速器（attenuato

9、r）”的作用。RNAi机制中最引人注目的亮点就是仅由2030nt组成的小dsRNA。它们是由RNaseIII酶（可以是Dicer单独发挥作用，也可以是Drosha和Dicer共同发挥作用）剪切长RNA得到的产物。按照小RNA的来源前体的不同，我们可以将其分为两大类：一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对病毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用其自身基因组编码的茎环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和内源性siRN

10、A（esiRNA）。不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥它们的靶向作用。简述小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转录产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链结构的RNA分子经由Drosha或Dicer等RNaseIII处理之后就能得到小dsRNA分子。如果这些小dsRNA分子之间的配对情况非常好，如图中左侧所示，那么就会经由Argonaute蛋白的酶切活性进行进一步处理，生成小ssRNA产物。如果像图中右侧所示的那样，小dsRNA分子之间的配对情况不是非常好，比如出现了错配或者有环状凸

11、出，那么它们就不能被Argonaute蛋白酶切处理，只能经由一种不依赖酶切活性的方式生成最终的小ssRNA产物。目前，我们对于究竟是哪种蛋白参与其中来发挥解链活性还不得而知。生成的小ssRNA分子随后会与Argonaute蛋白结合，但究竟是哪一条单链分子（正链或负链）结合到Argonaute蛋白上则取决于它们的热力学稳定性。结合了单链小RNA分子的Argonaute蛋白会根据单链RNA分子的序列寻找能够与其互补配对的mRNA分子，并与之结合，然后抑制它的表达。而究竟采用哪种机制沉默该基因的表达，比如是直接降解目的mRNA还是仅仅抑制其表达，在很大程度上取决于mRNA和小RNA分子之间的互补程度

12、。b、在秀丽隐杆线虫和某些植物细胞中发现，某些小RNA分子还可以通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）来合成。有一些天然转录产物（通常它们都是异常的转录产物）都是这种依赖RdRP途径合成的小RNA分子的前体来源物质。因此，缺乏RdRP活性的物种，比如哺乳动物和黑腹果蝇等物种体内是不会发现这种小RNA合成机制的。经过这种途径生成的小RNA分子随后同样也是与Argonaute蛋白相结合，发挥抑制靶基因表达的作用。c、有一类Argonaute蛋白只存在于生殖细胞当中，它们被称作PIWI亚科蛋白，它们可以与piRNA结合，随后形成的复合物能够沉默转座子。单链前体RNA分子在未知蛋白的作用下经过初步处

13、理过程形成piRNA。在生殖细胞内，PIWI蛋白在沉默转座子的同时还能大量扩增piRNA分子，这个过程被称作进一步处理过程，或者叫ping-pong扩增环路反应，这种反应在包括小鼠和斑马鱼在内的多个物种体内都广泛存在，非常保守。在这步反应当中，PIWI蛋白的剪切活性会不断剪切转座子转录产物（即piRNA的前体物质）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白质负责生成的，我们现在还不清楚。siRNA作为一种新兴的治疗技术，却已经以一种前所未有的速度迈进了临床试验阶段。下面，我们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病RNAi疗法。第一个被siRNA治疗指南批准获得临床研究新药（inv

14、estigationalnewdrug，IND）资格，并且进入了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Acuity制药公司生产的针对血管内皮细胞生长因子（VEGF）的siRNA类药物。该药主要用于治疗渗出性老年性黄斑变性。所谓渗出性老年性黄斑变性，主要是因为视网膜后血管大量生长，导致患者出现严重的不可逆性视力损伤。在小鼠试验中对Bevasiranib进行的临床前研究表明，直接眼部注射该药能够下调Vegf基因的表达，有效减少新生血管数量。还有两家公司也专注于用siRNA治疗黄斑变性疾病，他们分别是美国的MercksSirnaTherapeutics公司（主要产品是针对VEGF受体VEGF

15、R1蛋白的Sirna-027）和Quark制药公司。他们和伦敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制药公司）合作，主要生产靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，该基因与黄斑变性疾病的进展有关）这种缺氧诱导基因的siRNA产品RTP801i-14。RTP801i-14已经被授权给英国的Prizer制药公司，进行I/IIA期临床试验。Quark制药公司也已经获得了IND资格可以进行另一项临床前试验，他们目前正在为这项实验招募志愿者。这项实验的药物靶定TP53基因的siRNA。该药通过抑制p53蛋白的表达能够阻碍细胞凋亡通路，从而有望避免手术后出现的急性肾衰竭。与此同

16、时，美国的Calando制药公司也开始了新药的临床试验项目。他们实验的新药是用于治疗实体瘤的靶定核糖核苷酸还原酶RRM2（该酶参与DNA的合成）亚基的siRNA。值得一提的是，这是第一项使用受体介导递送方式的siRNA临床试验，该产品被连接有转铁蛋白的环糊精颗粒包裹。这样，药物就只会被细胞表面表达有转铁蛋白受体的细胞摄取，而转铁蛋白受体在肿瘤细胞表面表达量就非常高。Acuity制药公司与Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作进行的临床药物试验成功地稳定了患者的病情，阻止了病情进一步加重，明显改善了患者的视力，而且还没有副作用和不良反应。这些成果让我们对玻璃体内注射siR

17、NA这种治疗方法充满了信心。但是，Kleinman等人的报道给我们当头泼了一盆冷水。Kleinman等人认为，患者新生血管数量的减少并不是因为siRNA特异性的基因沉默作用，而是因为它非特异性地激活了TLR3受体，继而导致干扰素和白介素12活化，从而下调了VEGF因子的表达。换句话来说，特异性的siRNA药物和非特异性的siRNA对照药物都能因为siRNA与TLR3之间的相互作用而产生这种非特异性的血管生成抑制作用。而且，这种非特异性的效应与细胞对siRNA分子的摄取作用无关，同时由于TLR3蛋白参与细胞内多条信号通路，因此这也让我们对siRNA疗法的安全性问题感到了担忧。美国Alnylam制

18、药公司是一家专业的siRNA制药公司，他们的主打产品ALN-RSV01主要针对呼吸道合胞病毒感染（在美国每年有大约30万人会感染呼吸道合胞病毒）。它可以沉默病毒复制过程中必需的病毒核衣壳蛋白编码基因N基因。ALN-RSV01也是第一款进入临床试验的抗病毒siRNA产品，目前人们已经计划将试验对象扩展到儿科患者。就现有的试验结果来看，ALN-RSV01的疗效非常好，而且志愿者对它的耐受性也非常高。最近，Alnylam制药公司又与KyowaHakkoKogyo结成了独家合作关系，共同在日本和其他亚洲国家研发商业化的ALN-RSV01产品。Alnylam制药公司同时也在开发一系列治疗高胆固醇血症、亨

19、廷顿舞蹈病（与美国Medtronic共同开发）、丙型肝炎病毒（与美国Isis制药公司共同开发）、进行性多病灶脑白质病（与美国BiogenIdec公司共同开发）以及流感（与瑞士Novartis制药公司共同开发）等疾病的siRNA产品。国际雅-雷二氏综合征协会（TheInternationalPachyonychiaCongenitaConsortium，IPCC）也正与美国TransDerm公司合作，共同开发治疗雅-雷二氏综合征的siRNA产品。他们希望该产品能够“纠正”患者角蛋白的合成，从而达到治疗这种罕见的皮肤疾病的目的。美国希望之城医疗中心（TheCityofHopeNationalMed

20、icalCenter）正在与澳大利亚Benitec公司合作开发一款治疗艾滋病淋巴瘤的药物。该药物是一款使用了PolIII启动子载体的shRNA类药物，主要靶定HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外显子序列。它使用的载体是基于HIV病毒的一种慢病毒载体，同时在载体上还插入了另外两个RNA抗HIV基因，最后通过该载体将shRNA基因导入血液干细胞。在临床试验中，通过自体骨髓移植方式将这种经过基因改造的血液干细胞输入HIV病毒感染患者体内，看看是否能够起到治疗艾滋病相关骨髓瘤的作用。到目前为止已经有四位患者接受了这种治疗。正如前面提到的那样，在siRNA药物研发领域合作已成为非常普遍的现象。通过

21、合作可以获得更多的好处，比如获得更多的科研资金，缩短最后药物成品上市的时间等等。有一些公司，比如美国RegulusTherapeutics公司等则将目光投向了miRNA。丹麦Santaris制药公司最近也开始为他们靶定人体miRNA分子（miR-122）的新药开始了I期临床试验项目。在该项药物试验里，miR-122是被下调的靶标，被试验的药物是抗miRNA的锁核酸药物SPC3649。锁核酸是一种骨架被修饰过的寡核苷酸分子，经过修饰之后它能更好地与底物杂交，避免底物被核酸酶降解。SPC3649最终的目的是希望能够治疗丙型肝炎患者，因为miR-122可以促进丙型肝炎病毒复制。下调miR-122分子

22、还能用于治疗高胆固醇血症患者。直接靶定在心脏里表达的miRNA分子，比如miR-208（它能够调控心脏肥大和纤维化）等也会达到治疗目的，因为在医疗实践中早就发现直接往靶器官里给药是可行的。miRNA功能的获得或缺失与各种疾病的发生发展都有着密切的关系。蛋白质功能既可以直接也可以间接地受miRNA分子的调控，因此，miRNA表达水平的些许改变也会对基因表达调控带来巨大的影响。在因为miRNA表达水平改变而造成的疾病中，我们可以设想是否如此，如果能使miRNA表达水平恢复正常，那么就应该能够治愈该疾病呢？那么如果是这样，当miRNA表达水平过高时我们就对其进行针对性下调，如果表达水平过低我们就往细

23、胞内注入一些类似的miRNA模拟物。不过要达到这个目的，我们现有的小RNA递送系统的特异性和有效性都还有待提高。另外，要想对目标miRNA分子表达水平进行精细、准确的调控并非一件容易的工作，而且人们现在还不清楚能否精确地只对一个miRNA分子施加影响而不会“伤及”同一miRNA分子家族中的其它成员。在实际治疗时，不论是上调还是下调miRNA的功能，我们都还应该考虑到miRNA分子调控机制的复杂程度。要知道一个miRNA分子就可以调控数百个蛋白质的表达水平，因此我们哪怕对一个miRNA分子进行调控也要特别小心。将siRNA分子用于临床治疗会产生很多安全性问题。完成了最初的试验之后，有很多报道都指

24、出了这种新兴疗法可能存在很多潜在的安全问题。最早报道的是在一项小鼠试验中，使用PolIII启动子载体在肝脏中表达shRNA进行治疗，结果导致试验小鼠死亡。具体的致死机制现在还不清楚，但是至少有部分原因可能是因为负责将miRNA分子从核内转运到胞质中的转运因子输出蛋白5（exportin5）出现了饱和。现在其它试验数据也表明很多参与RNAi处理过程的因子在细胞大量表达外源性siRNA时都会被这些小RNA分子所饱和，因此就无法转运正常的细胞内源性miRNA分子。由于每一个细胞miRNA都能够调控上百种基因的表达，因此对miRNA途径哪怕只带来一点小小的扰动也会造成非常严重的后果。要解决这个问题有一

25、种办法就是设计能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA的长度），这样就能在达到同样治疗效果的前提下使用最低剂量的siRNA药物。这些RNA分子经过Dicer酶切割之后就进入了RNAi途径，这样相比直接使用外源性的21nt的siRNA药物通常都能够以更低的剂量达到更好的基因沉默效果。虽然少量的siRNA分子应该不足以饱和整个RNAi体系，但是它们也能够与其它miRNA竞争RISC复合体进入位点。这种竞争会造成什么样的远期结果现在还不清楚。使用微阵列芯片可以很明显地发现，往胞内导入外源性siRNA分子之后会改变靶基因的表达水平，但同时也能改变其它非靶基因的表达状况，因为仅凭6、7个

26、核苷酸互补序列的结合就会通过一种miRNA样机制产生特异性的脱靶效应。不过，微阵列芯片只能够反映mRNA水平的改变，不能够反映翻译水平的改变，因此我们还不能明确这种脱靶效应会造成多大的影响。由于使用人工合成的siRNA只能短期抑制细胞基因的表达，因此在临床实践中，这种特异性的脱靶效应可能还不是一个大问题。不过无论如何，在进行适当的毒性试验时我们都应该考虑siRNA与非靶基因mRNA3端UTR区域结合后可能出现的问题。在进行siRNA设计的时候可以采取一些策略，尽量减少这种脱靶情况的发生。比如，在siRNA双链分子中引入2-O-Me修饰或者进行DNA替换都能够明显降低脱靶现象的发生率。改变热稳定

27、性或者封闭正义链5端的磷酸化位点，这都能改善反义链选择过程，这对于降低脱靶率也是非常有帮助的。RNAi机制是一条非常保守的作用机制，它最初的作用可能是帮助物种抵抗病毒的感染。如果是这样，我们也就不会感到奇怪，为什么在某些情况下siRNA能够起到Toll样受体激动剂的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶的序列或者富含鸟嘌呤及尿嘧啶的序列能够诱导细胞的免疫应答。siRNA能够刺激细胞出现免疫应答不仅是因为它的序列，还可能是因为它的结构、所使用的递送系统或者细胞类型等等因素。虽然这种免疫刺激在某些情况下可能会有所帮助，但是通常来说我们都不希望它发生。上面提到的TLR3反应对VEGF或VEGF受体起到的非序

28、列特异性调控作用，以及另一起报道中提到的在鼠类动物模型中，靶定巨噬细胞迁移抑制因子（migrationinhibitoryfactor，Mif）的siRNA和非特异性的对照siRNA分子都能够通过能激活蛋白激酶（PKR）的dsRNA的活性增强乳腺癌细胞的增殖能力。上述无一不提示我们，在解释siRNA体内实验结果时一定要倍加仔细。虽然我们还没能找到一种方法可以避免所有的脱靶效应，但是可以预见，使用恰当的RNA修饰方法和递送途径，从而使RNA分子避免接触天然免疫系统的受体，我们就一定能够解决脱靶这个问题。所谓基因疗法(genetherapy)通常是指为病人补充他所缺乏的基因产物(一般是蛋白质)。某

29、些情况下补充过量的某种蛋白质可以起到稳定和改善病情的作用。然而，在用基因疗法治疗某些疾病-例如由于病毒感染或是由于病毒基因组编码的外源基因侵入机体而导致的疾病时-适当关闭或是下调某个基因的表达也十分重要。癌症就是个典型的例子，体内正常基因的不正确表达或是发生功能获得性突变(gain-of-functionmutation)都有可能改变细胞周期、加剧细胞增殖失控，从而引发癌变。miRNA/RNAi用于基因治疗的想法最初源于一些从事基因治疗行业的科研人员在实际工作中遇到的问题，如“RNAi和miRNA介导的基因敲除之间有何区别”以及“在以前基因敲除技术并不成熟的时候，RNAi是否真的能发挥效用”。

30、显然，诸如此类的问题并没有简单或是明确的答案。即便如此，要想解决这些问题，我们首先要给出一个明确的定义，即RNAi和miRNA分子都是短小的、双链RNA分子(大约21碱基对的长度)，这些RNA分子可以在转录后水平上部分或完全沉默某一特定基因的表达。而该过程仅在mRNA含有小RNA同源靶序列时才会发生。RNAi比以前各种基于基因敲除的基因治疗法都要成功的主要原因是一切哺乳动物细胞中都存在内源性RNAi/miRNA。RNAi和miRNA通路之间存在很多显著的异同之处，一般来说，RNAi会造成基因位点特异性的断裂，而miRNA的敲除功能则源于mRNA的翻译抑制和/或mRNA更新率的提高。小RNA和它

31、的mRNA的靶位点完全互补匹配时会活化由RNAi引起的断裂途径，而miRNA介导的抑制过程只需二者间有部分序列匹配即可。一般越低等的生物，它们的RNA越有可能通过介导相应基因染色质或DNA的修饰来触发转录后的抑制过程，而在哺乳动物中是否存在这一过程尚存有争议。人们通过对哺乳动物基因组内源miRNA基因序列进行相关研究，发现至少存在500个或更多不同类型的RNA调控着我们机体内大约1/3的基因。这一调控过程进一步加强了生物体在发育过程、细胞周期以及免疫和代谢途径中对基因复杂的调控网络的控制。当然，这些miRNA是如何被控制的还有待进一步探索，但现在已有很多科研人员尝试研究这些生理过程的异常调节对

32、诸如神经功能缺损、癌症、免疫失调以及感染的发病意义。当RNAi在一次不经意的植物转基因研究过程中首次作为一个概念被提出后，其作用机理最早由Fire、Mello等人于九十年代末在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中阐明(Fireetal.,2019)，这一发现获得了2019年的诺贝尔医学和生理学奖。起初，这项发现曾引起人们对于哺乳动物是否存在RNAi现象这一问题产生了极大的争论。基于RNAi技术的疗法可以被分为两大类，第一类是成熟的siRNA分子以双链裸露的RNA形式或RNA与载体结合的方式被传递。RNA的核苷酸可以被修饰，以降低其毒性并/或当运输至含有核酸酶的体液时延长

33、其活性。由于siRNA在细胞内的半衰期有限，因此它们的活性在细胞内会受到限制。第二类是用DNA作为转录模板以使短的含发夹结构的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。尽管这些疗法都受到载体的限制，但一般都会产生强烈且持久的RNAi活性。过去几年，不断有人尝试在临床前期的疾病模型中应用小RNA。在这些尝试中至少有6个临床实验获得了成功，其中包括了用载体表达的shRNA和基于siRNA技术的基因疗法，这些疗法都很有希望应用于临床药物的开发。在前人的这些临床实验的启示下，下一步关键问题是明确影响小RNA基因疗法效率的关键因素究竟是因为基因敲除的特异性，还是因为存在多种非特异性应答形式。在过去的十年里，小RNA在生物动态平衡中所扮演的角色越来越为人们所了解。但是，即使有新型技术(尤其是大规模测序平台)的支持，我们对于小RNA具体功能的认识还只处于表面阶段。对内源RNAi/miRNA途径的阐明不但使人们对基因的调控和功能有了更清晰的了解，而且也帮助我们在细胞中发现更多其它类型的小RNA，不过这些小RNA产生的机制以及它们在基因调控过程所起的作用还不甚明确，但对于研究RNA的生物学家及探索疾病治疗新技术的医学工作者而言，这些发现十分振奋人心。毫无疑问，小RNA技术已