食品生物技术导论基因工程课件.ppt

1、基因工程是生物工程的核基因工程是生物工程的核心技术，是最具生命力和心技术，是最具生命力和最引人注目的前沿学科之最引人注目的前沿学科之一。一。-教学目标1 1、了解基因工程的产生及发展、了解基因工程的产生及发展2 2、掌握基因工程的概念和特点、掌握基因工程的概念和特点 3 3、掌握基因工程的四大要素、掌握基因工程的四大要素 4 4、掌握基因工程的原理和过程、掌握基因工程的原理和过程 5 5、了解基因工程在食品工业中的应用、了解基因工程在食品工业中的应用-第一节第一节 基因工程概述基因工程概述一、基因及其发展简史一、基因及其发展简史二、基因工程涵义二、基因工程涵义三、基因工程的一般步骤三、基因工程

2、的一般步骤-41 1、基因概念、基因概念l基因基因是是DNA分子上具有遗传效应的分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列。特定核苷酸序列。l指导人体内重要物质蛋白质等的合指导人体内重要物质蛋白质等的合成，维持着人体的正常生理功能。成，维持着人体的正常生理功能。如果一个基因不正常，甚至基因中如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，就可以一个非常小的片断不正常，就可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。引起发育异常、疾病，甚至死亡。基因是基因工程基因是基因工程的操作对象的操作对象-5基因（基因（gene）生命的最大奥秘生命的最大奥秘物质层面：物质层面：是染色体上一段是染色体上一段脱氧核糖核酸脱氧

3、核糖核酸 （DNA）序列。）序列。功能层面：功能层面：是遗传信息的载体，编码蛋白质和核糖核酸是遗传信息的载体，编码蛋白质和核糖核酸（RNA）分子功能，调控基因表达。）分子功能，调控基因表达。基因基因1 1基因基因2 2DNA染色体染色体-6DNA结构结构戊糖戊糖磷酸磷酸单核苷酸单核苷酸碱基碱基脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸基通过基通过3,5磷酸磷酸二酯键连接形成二酯键连接形成螺旋链的骨架螺旋链的骨架-73端端3端端5端端5端端磷酸二酯键磷酸二酯键-碱基处于螺碱基处于螺旋的内侧旋的内侧-91865 孟德尔的豌豆实验孟德尔的豌豆实验l发现了遗传规律： 同对因子分离 异对因子自由组合 l首次提出了“遗

4、传因子”（即基因）现代遗传学之父，奥地利生物学家格雷戈尔孟德尔 2 2、基因发展简史、基因发展简史-101915年至年至1928年摩尔根的果蝇实验年摩尔根的果蝇实验l进一步证实了孟德尔因子和孟德尔定律两大重要发现：基因是在染色体上，l遗传的基因链锁和互换定律。 即建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。美国遗传学家摩尔根 -111953年最伟大的模型年最伟大的模型 DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型l提出的提出的DNA右手双螺旋结构，在英右手双螺旋结构，在英国国自然自然杂志上发表了论文并杂志上发表了论文并1962年获得诺贝尔奖。年获得诺贝尔奖。l提出了提出了DNA的复制机制的复制机制即半保留即

5、半保留复制。复制。美国生物化学家沃森（左一）英国生物物理学家克里克 ( 左二）从分子水平揭示了从分子水平揭示了种瓜得瓜，种豆得种瓜得瓜，种豆得豆的遗传机理豆的遗传机理-DNA半保留复制半保留复制lDNA复制时每个子代复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。-二、基因工程涵义二、基因工程涵义-141、基因工程诞生的基础、基因工程诞生的基础（1）理论上的三大发现）理论上的三大发现 l20世纪世纪40年代确定的遗传信息的携带者是年代确定的遗传信息的携带者是DNA而而不是蛋白质（不是

6、蛋白质（肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验） l50年代揭示的年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型和半保分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。留复制机制。 l50年代末年代末60年代：年代：中心法则中心法则操纵子学说及遗操纵子学说及遗传密码的破译。传密码的破译。-15-16中心法则描述的是遗传信息传递表达路径的原理。中心法则描述的是遗传信息传递表达路径的原理。-17（2）基因工程研究的理论依据）基因工程研究的理论依据l基因可以重组互换基因可以重组互换 l基因可切割基因可切割 l基因可转移基因可转移l遗传密码是通用的遗传密码是通用的l多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系 l基因

7、可通过复制把遗传信息传递给下一代基因可通过复制把遗传信息传递给下一代-18（3）技术上的三大发明）技术上的三大发明 l60年代末年代末70年代：年代：DNA分子的体外切割与连接技分子的体外切割与连接技术。术。 l70年代：基因工程载体的使用。年代：基因工程载体的使用。 l70年代：年代： DNA分子的序列分析、琼脂糖凝胶电泳、分子的序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂交技术等。杂交技术等。 1973年年Cohen等体外构建细菌质粒的成功标志着基等体外构建细菌质粒的成功标志着基因工程诞生，这年定为因工程诞生，这年定为基因工程诞生元年基因工程诞生元年。-2、基因工程概念、基因工程概念(Gene engin

8、eering)l指用指用酶学方法酶学方法将将异源基因异源基因与与载体载体DNA进行进行体外重组，体外重组，将形成的重组将形成的重组DNA导入导入宿体细胞宿体细胞，使异源基因在宿，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类大量生产出人类所需的生物品种和产物所需的生物品种和产物，也称分子，也称分子克隆或重组克隆或重组DNA技术。技术。工具酶工具酶目的或靶基因目的或靶基因( 源自供体源自供体 )受受 体体载载 体体基因工程的基本内容和关键技术最终目的-203、基因工程的主要内容、基因工程的主要内容l从生物有机体基因组中，分

9、离出带有目的基因的从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。片段。l将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组记号的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。l将重组将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。起增殖。l从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。并筛选出已经得到扩增的目的基因。l将目的基因克隆到表

10、达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。-三、基因工程的一般步骤三、基因工程的一般步骤-22生物材料生物材料RNADNAmRNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成目的基因目的基因克隆载体克隆载体重组重组DNA受体细胞受体细胞克隆子克隆子转基因生物转基因生物1 1、基因工程基本技术路线、基因工程基本技术路线-剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达2、基因操作、基因操作的基本步骤的基本步骤载载 体体供体供体目的目的基因基因受受 体体工具酶工具酶-

11、24即基因工程是基因的一种操作平台与技术基因工程五大基本操作单元： 切、接切、接、转、增转、增、检检 DNA的体外的体外重组重组转化子的筛转化子的筛选与鉴定选与鉴定某一段某一段DNA可在受体细胞可在受体细胞内进行复制，为制备大量内进行复制，为制备大量纯化的纯化的DNA片段提供可能片段提供可能 可把来自任何生物的基可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中的任何其他受体细胞中 重组重组DNA分子的分子的转化与扩增转化与扩增-25l工具酶工具酶 l目的基因（制备）目的基因（制备）l基因载体基因载体 l基因受体基因受体 基因工程四大要素基因工程四大要素-第二节第

12、二节 工具酶工具酶基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶酶作为工具作为工具-27一、限制性内切酶一、限制性内切酶（Restriction endonuclease） 1、概念、概念l指一类以环形或线形双链指一类以环形或线形双链DNA为为底物底物，能识别双链，能识别双链DNA中中特殊核苷酸序列特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的每条链一定位点上的磷酸二酯键磷酸二酯键断开，产生具有断开，产生具有3-OH和和5-P基团的基团的DNA片段片段的内切脱氧核糖核酸酶。的内切脱氧核糖核酸酶。-28lI型酶：在识别位点很远的地方任

13、意切割型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。异性差，且需辅助因子，应用价值不大。 lII型酶：型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需子或只需Mg2+，适合基因工程。，适合基因工程。 lIII型酶：在识别位点之外切开型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，

14、因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。 2、限制性内切酶种类、限制性内切酶种类-29 1973年由年由H.O Smith和和D. Nathans提议的命名系统提议的命名系统 l由三部分构成，即由三部分构成，即菌系编号、菌株名、分离顺序菌系编号、菌株名、分离顺序。 （1）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成的组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。 大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示； 流感

15、嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。 （2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面。如Ecok, EcoR （3） 同一菌株中有不同的限制性内切酶时，按分离顺序用罗马字母表示，正体书写。如EcoR I，EcoR V。 3、限制性内切酶命名原则、限制性内切酶命名原则-30例如：流感嗜血菌例如：流感嗜血菌d株株 属名属名 种名种名 株名株名Haemophilus influenzae dHind -31（1）作用机制）作用机制l限制性内切酶以环状或线性的双链限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为为底物底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，

16、在两条在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的链的特定的磷酸二酯键磷酸二酯键上催化切开，产生具有上催化切开，产生具有3-OH和和5-P基团基团的的DNA片段。片段。4、限制性内切酶作用机制和方式、限制性内切酶作用机制和方式-（2）酶切特点）酶切特点l识别双链识别双链DNA分子中分子中48对碱基的特定序列对碱基的特定序列l大部分酶的切割位点在识别序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧内部或两侧l识别切割序列呈典型的对称识别切割序列呈典型的对称回文结构回文结构。 EcoR的切割位点的切割位点 EcoR的识别序列的识别序列 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G

17、-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5切割位置识别结构识别长度-33l识别序列：识别序列：限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNADNA上能够识上能够识别的特殊核苷酸序列别的特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短的出。（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然）现几率大，反之亦然）l稀切酶：稀切酶：能够识别长序列及富集能够识别长序列及富集GCGC和和ATAT的识别序列的识别序列（几率小）的内切酶。（几率小）的内切酶。l同裂酶：同裂酶：识别相同序列的限制酶识别相同序列的限制酶l同尾酶：同尾酶：识别序列不同，但切割得到的识别序列不同，但切割得到的DNADNA片段具片段具有相同的黏性末端

18、。有相同的黏性末端。各种类型见各种类型见P18-19-黏性末端：黏性末端：被限制酶被限制酶交错切开交错切开的的DNA两条单链两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（基正好互补配对。（5粘性和粘性和3粘性）粘性） G A A T T CC T T A A GG C T T A AA A T T C G（3）切割方式）切割方式5-P3-OH3-OH5-P5-P5-P3-OH3-OHEcoR形成具有互补碱基形成具有互补碱基序列的单链黏性末序列的单链黏性末端端5-GAATTC-3-35EcoR产生的产生的5粘性末端粘性末端 5G-C-T

19、-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C53747 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoR-36PstI产生的产生的3粘性末端粘性末端 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5 5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G3 3C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T

20、-C53747 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3 3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI-37例如：例如：EcoR V 的识别位置是：的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 其切割后形成其切割后形成5 GAT和和ATC 3、 3 CTA和和TAG 5。平整末端：平整末端：同一位点同一位点平齐切割平齐切割DNA两条两条链而形成的双链末端。链而形成的双链末端。 -l反应底物反应底物 （DNA）l内切酶用量内切酶用量 （活力决定）（活力决定）l反应缓冲液反应缓冲液 （最适（最适pH 7.5）l适当的温度（适当的温度（37）5、限制性内切核

21、酸酶反应系统、限制性内切核酸酶反应系统-39反应系统缓冲液反应系统缓冲液lTris-HCl 50mM pH 7.5lMgCl2 10mM 低盐酶：低盐酶： 050mMlNaCl 0150mM 中盐酶：中盐酶：100mMlDTT/BSA 1mM 高盐酶：高盐酶：150mMlVolume 20100LlT,T 37，11.5hl1U核酸内切酶的活性：核酸内切酶的活性：在最佳反应条件下反应在最佳反应条件下反应1小时，完全水解小时，完全水解1 g标准标准DNA所需的酶量。所需的酶量。-40l琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极

22、泳动，在外加电场作用下向正极泳动， 不同的不同的DNA，分子量，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳的驱动力靠同的区带。电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷骨架本身的负电荷。l聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。使用特点：使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。 鉴定鉴定凝胶电泳凝胶电泳-41-观察观察: :凝胶成像系凝胶成像系统统-pBI121双酶切大片段的获得 Big f

23、ragment obtained from pBI121 after double enzyme digestion pMD18-T curcin双酶切小片段的获得 Small fragment obtained from pMD18-T curcin after double enzyme digestion13 kb13 kb 酶切片段酶切片段-46二、二、DNA连接酶连接酶1 1、概念：、概念：能催化能催化DNA分子中相邻的分子中相邻的3-OH和和5-P末端之间形成末端之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键，即可封闭双链，即可封闭双链DNA上相上相邻核苷酸之间的单链缺口。邻核苷酸之间的单链缺口。-

24、472、主要的两种、主要的两种DNA连接酶连接酶 （1）大肠杆菌大肠杆菌-DNA连接酶：连接酶：只能连接黏性末端 ，需NAD+为辅助因子。（同一种限制酶或两种同尾酶）（2）T4-DNA连接酶：连接酶：连接黏性末端、平整末端，需ATP为辅助因子。 （同一种或两种限制酶） 作用：作用：DNA重组中促使载体与目的DNA连接（即两种来源的DNA）。（最适温度37，或415）- 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C537EcoR 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C

25、-T-C5P-A-A-T-T-C-X-Y-G-OH OH-G-Y-X-C-T-T-A-A-P大肠杆菌大肠杆菌连接酶连接酶-X-Y-Y-X-载载 体体供体供体目的目的基因基因受受 体体工具酶工具酶-（1）DNA片段末端修饰片段末端修饰l核酸外切酶：切成平整末端核酸外切酶：切成平整末端l末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端l碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶：将5-P修饰成修饰成5-OH，防止载体自我，防止载体自我环化环化（2）DNA片段加连杆后连接片段加连杆后连接l人工合成连杆或衔接头人工合成连杆或衔接头3、非互补黏性末端、非平整末端的连接、非互补黏性末端、非平整末端的

26、连接-51三、其他工具酶三、其他工具酶lDNA聚合酶：聚合酶：PCR扩增扩增lT4多聚核苷酸激酶：催化多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至上磷酸转移至5-OH上，作为上，作为DNA的的 5-末端标记。末端标记。lS1核酸酶：分析核酸酶：分析DNA-RNA杂合子结构；杂合子结构；l反向转录酶：以反向转录酶：以RNA为模板，反向转录形成与为模板，反向转录形成与已知已知RNA互补的互补的DNA链（构建链（构建cDNA文库）。文库）。-52第三节第三节 目的基因的制备目的基因的制备一、生物学方法一、生物学方法二、化学合成法二、化学合成法三、基因文库法三、基因文库法四、四、PCR扩增法扩增法-531、

27、目的基因的定义、目的基因的定义 l目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或表达的特定基因或DNADNA片段，能编码某一产物片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。或某一性状，又称特异基因或靶基因。 2、目的基因的来源、目的基因的来源l 真核生物染色体基因组（人和动物）；真核生物染色体基因组（人和动物）；原核生原核生 物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。-54一、生物学方法一、生物学方法l工作原理：工作原理：把染色体把染色体DNA用用限制内切酶限制内切酶切切割，将所有片段链接到割，将

28、所有片段链接到某载体某载体上，转入上，转入大大肠杆菌中增殖肠杆菌中增殖。再用适当方法筛选出含目。再用适当方法筛选出含目的基因的的的基因的的重组体菌落重组体菌落，从重组体菌落提，从重组体菌落提取取DNA，经酶切后获得目的基因。，经酶切后获得目的基因。-55ori目的基因目的基因EcoR IBamH IPst I对象：对象：原核生物基因组较小，基因容易定原核生物基因组较小，基因容易定位位 ，或已知核苷酸序列的，或已知核苷酸序列的DNA分子。分子。优点：优点：快速简便、产物纯度高。快速简便、产物纯度高。-56二、二、 化学合成法化学合成法 如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推

29、导出该多肽编码基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 通常是先合成一定长度（200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。 然后将寡核苷酸适当连接组装成完整的目的基因-57 合成引物合成引物 合成合成DNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆 合成基因片断合成基因片断 DNA片断的连接重组，采用片断的连接重组，采用DNA片段的连片段的连接酶有接酶有E.coli DNA 、T4-DNA连接酶连接酶步步 骤：骤：-58l 工作原理：工作原理：把某种生物把某种生物基因组的全部遗传信息基因组的全部遗传信息通通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之

30、中，这个群体即为这种生物的基因组文库。这个群体即为这种生物的基因组文库。l 包含某种生物基因组全部基因的受体菌群体称为包含某种生物基因组全部基因的受体菌群体称为该生物的基因组文库。该生物的基因组文库。三、基因文库法三、基因文库法-抽提基因组抽提基因组DNA制备制备DNA片段片段DNA片段与载体重组片段与载体重组转化宿主菌体转化宿主菌体筛选目的基因筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）（核酸探针法、免疫结合法）基因文库构建流程图基因文库构建流程图物理方法物理方法(剪切或超声波剪切或超声波)或或限制性内切酶限制性内切酶 噬菌体、噬菌体、plasmid、YAC等等每个细菌内都携带一种每个细菌内都携带

31、一种重组重组DNA分子的多个分子的多个拷拷贝。全部细菌所携带的贝。全部细菌所携带的各种染色体各种染色体DNA片段片段就就涵盖了基因组全部信涵盖了基因组全部信息，即基因文库。息，即基因文库。-60构建构建基因基因library+ ligase-61A plasmid library-62四、四、PCR扩增法（聚合酶链式反应）扩增法（聚合酶链式反应） Polymerase chain reactionlPCR技术是基因扩增技术的一次重大革新；技术是基因扩增技术的一次重大革新；l1985年美国年美国PE-Cetus 公司的公司的Millis等研制，于等研制，于1993年获年获诺贝尔化学奖。诺贝尔化学

32、奖。lPCR技术是指模拟技术是指模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异在体外进行特异DNA序列合成及扩增的技术。序列合成及扩增的技术。l前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。引物。- PCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNA的天然复制的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物。解旋酶双链变单链DNA聚合酶使链延伸引物DNA的天然复制的天然复制-641、PCR原理原理lPCR技术的实质为体内技术的实质为体内DNA复

33、制的体外模拟。复制的体外模拟。l即即使双链使双链DNA热变性热变性而分开成为单链而分开成为单链DNA，退火退火后在后在低温下，两个与低温下，两个与模板模板互补的互补的引物引物与单链与单链DNA配对结合，配对结合，再在中温下利用再在中温下利用Taq DNA聚合酶聚合酶的聚合活性和热稳定的聚合活性和热稳定性进行性进行聚合（延伸）反应聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何序列数量按几何指数增长。指数增长。-65PCR技术原理技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。55C

34、在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72C变性变性退火退火延伸延伸-PCR技术技术原理原理示意图示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复性物复性循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复性物复性链延伸链延伸Tag聚合酶聚合酶链延伸链延伸-67PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增-6820-35 cycles72 57 min4 12 h或更长时间或更长时间72 24 min94-96 0.51 min9296 46 mi

35、n6037 0.5-1 min变性使双链变性使双链变为单链变为单链退火使复性退火使复性-引物引物与模板与模板DNA结合结合Tac聚合酶使聚合酶使延伸延伸2、PCR反应过程反应过程-69 模板模板DNA的变性：的变性：模板模板DNA加热至加热至9495一定一定时间后，使模板时间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；应作准备； 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板模板DNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板左右，引

36、物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；2、PCR反应步骤反应步骤-引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板引物结合物在引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板的与模板DNA 链互补的半保留复制链。链互补的半保留复制链。 重复循环重复循环“变性变性-退火退火-延伸延伸”过程，就可获得过程，就可获得更多的更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成为，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需

37、下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。-71PCR扩增仪扩增仪-723、PCR反应体系反应体系l反应缓冲液反应缓冲液 18（ l） ldNTP（原料基质，由（原料基质，由四种三磷酸脱氧核苷酸四种三磷酸脱氧核苷酸l 即即dATP、dGTP、dTTP、dCTP组成）组成） 2 lPrimer1（引物）（引物） 0.5 lPrimer2（引物）（引物） 0.5 lDNA分子（模板）分子（模板） 1 lMg2+（酶的辅助因子，（酶的辅助因子，10buffer） 2.5 lTaq酶（酶（DNA聚合酶）聚合酶）

38、 0.5-734、PCR的特点的特点l灵敏度高灵敏度高PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。l特异性强特异性强引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的基本原则是最大限度地提反应结果的关键；引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。l简便、快速、重复性好简便、快速、重复性好一次性加好反应液，24小时完成扩增。 l对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 。-第四节第四节

39、 基因克隆载体基因克隆载体 一、质粒一、质粒二、二、噬菌体噬菌体 三、其他三、其他-基因载体的概念基因载体的概念l将外源将外源DNA或目的基因带入适当宿主或目的基因带入适当宿主细胞（细胞（host cell）的工具或运载体。）的工具或运载体。-l本身是一个复制子，能自我复制；本身是一个复制子，能自我复制；l相对分子质量较小相对分子质量较小，限制性内切酶切点少，宜于接，限制性内切酶切点少，宜于接受目的基因；受目的基因；l能给宿主细胞（受体）提供可能给宿主细胞（受体）提供可选择标记选择标记， 有可供辨认的表形特征，便于筛选；有可供辨认的表形特征，便于筛选；l只有单一限制性内切酶切点只有单一限制性内

40、切酶切点，即经某限制性内切酶，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源闭环打开接纳外源DNA片片段，又不会丢失自己的片段。段，又不会丢失自己的片段。以指示载体或重以指示载体或重组组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞利于载体制备利于载体制备载体应具备的条件：载体应具备的条件：提高外源基提高外源基因的装载量因的装载量-77一、质粒一、质粒l质粒（质粒（plasmid）是寓于宿主细胞中染色体外的遗是寓于宿主细胞中染色体外的遗传因子，是传因子，是双螺旋闭环的双螺旋闭环的DNA分子分子。独立于染色。独立于染色体之外进行复制和遗传，又依赖于宿主编码的酶体之外

41、进行复制和遗传，又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录，和蛋白质来进行复制和转录， 相对分子量相对分子量100010000ku。l广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，某些广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。-78染色体和质粒的区别与联系染色体和质粒的区别与联系l染色体与质粒均与生物遗传有关。染色体与质粒均与生物遗传有关。二者都带有能转录并能表达为蛋白质的基因，染色体二者都带有能转录并能表达为蛋白质的基因，染色体是生物信息的携带者，其带有大量遗传信息，而质粒是生物信息的携带者，其带有大量遗传信息，而质粒则是携带一些

42、表达有特殊功能的蛋白质的基因，有些则是携带一些表达有特殊功能的蛋白质的基因，有些是对生物绝对需要的。是对生物绝对需要的。 l染色体与质粒化学本质不同：染色体与质粒化学本质不同：染色体的化学本质是染色体的化学本质是由蛋白质和由蛋白质和DNA组成的，质粒是组成的，质粒是DNA，只有质粒可以，只有质粒可以作为运载体，染色体不可以。作为运载体，染色体不可以。 -质粒载体的一般特征质粒载体的一般特征染色体染色体DNADNA质粒质粒DNA1plasmid4036bpORi抗 生 素 抗 性 基 因控 制 质 粒 转 移 的 基 因大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞-801、质粒类型、质粒类型l 严紧型质粒：严紧型质

43、粒：处于处于“严紧控制严紧控制”之下，之下，即即其复其复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝贝。这称为。这称为“严紧型严紧型”质粒。质粒。-l 松弛型质粒：松弛型质粒：处于处于“松弛控制松弛控制”之下，每个细菌中之下，每个细菌中可以有可以有10200份拷贝份拷贝。更重要的是松弛型质粒的。更重要的是松弛型质粒的拷贝数可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千拷贝数可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份，如份，如pBR322。宿主细胞不合成蛋白质时，宿主细胞不合成蛋白

44、质时，染色体和严紧型质粒的染色体和严紧型质粒的复制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。因此复制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素氯霉素处处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。合成。-2、质粒、质粒DNA的提取的提取l选择性抽提法：选择性抽提法：在较温和的条件下，用溶菌酶溶菌，形成的在较温和的条件下，用溶菌酶溶菌，形成的细胞碎片因染色体细胞碎片因染色体DNA和质粒和质粒DNA有相对分子量上的差异，用有相对分子量上的差异，用高速离心方法分离。相对分子量较小的

45、质粒高速离心方法分离。相对分子量较小的质粒DNA留于上清液，留于上清液，经乙醇沉淀得到质粒经乙醇沉淀得到质粒DNA粗制品。粗制品。l碱性碱性SDS法：法：在在pH12.012.5范围内使染色体中双螺旋开链范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，不变性。经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的复合物和相对分子质量高的DNA沉淀，再沉淀，再经高速离心将质粒经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。留于上清液中而分离。-碱性碱性SDS法提取质粒法提取质粒DNA的步骤的步骤收集细胞收集细胞加入加入溶液溶

46、液I (50mM 葡萄糖葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）溶菌酶）加入加入溶液溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS)加入加入溶液溶液III (3M NaAc pH4.8)离心除去沉淀，得含质粒离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液的上清液苯酚抽提去除蛋白质苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境在强碱性环境中暴露时间过中暴露时间过长，长，cDNA可发可发生不可逆变性生不可逆变性-843、质粒、质粒DNA的纯化的纯化l碱性蔗糖密度梯度离心法：碱性蔗糖密度梯度离心法：染色体双螺旋开链染色体双螺旋开链DNA易变易变性

47、，而闭环双链质粒性，而闭环双链质粒DNA不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性沉降速度大于变性DNA而分离纯化。而分离纯化。l氯化铯氯化铯-溴化乙锭（溴化乙锭（Et-Br）密度梯度离心法：）密度梯度离心法：染色体染色体双螺旋开链双螺旋开链DNA易和染料易和染料Et-Br结合而密度降低，质粒结合而密度降低，质粒DNA由于紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。由于紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。l硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附单链硝酸纤维素膜吸附单链DNA，染，染色体色体DNA易变性形成单链，而与质粒易变性形成单链，而

48、与质粒DNA分离。分离。-85l删除非必需区：删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量（一般来说，大于的装载量（一般来说，大于20kb的质粒很的质粒很难导入受体细胞）。难导入受体细胞）。 l加入新的遗传标记基因：加入新的遗传标记基因： l引入具有多种限制酶识别及切割位点的引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序序列：列：即多克隆位点即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)。 4、质粒的改造构建、质粒的改造构建-常用质粒载体：常用质粒载体：（1）大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒载载体体AmprTet rpBR322pBR322BamB

49、amHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)识别位点识别位点pBR322（4363bp）pBR322（含两个抗生素抗性基因）（含两个抗生素抗性基因）抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗四环素抗四环素复制起始点复制起始点- pUC18/19半乳糖苷酶的肽基因半乳糖苷酶的肽基因菌落蓝菌落蓝/白选择标记白选择标记加入加入-lacZ蓝蓝-白斑筛选白斑筛选l 具有完整乳糖操纵子的菌体具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译能翻译LacZ基因编码基因编码半乳糖半乳糖苷酶苷酶，该酶能水解生色底物，该酶能水解生色底

50、物X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源株变蓝。当外源DNA插入后，插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝称之为蓝-白斑筛选。白斑筛选。-（2）穿梭质粒载体（）穿梭质粒载体（shuttle vector）l 指指能在两种不同生物中复制的质粒载体能在两种不同生物中复制的质粒载体。如有的。如有的质粒载体除了含大肠杆菌源质粒的质粒载体除了含大肠杆菌源质粒的ori外，还含有蓝外，还含有蓝藻源质粒的藻源质粒的ori，是这两种生物的穿梭质粒载体；还