[生物学]第4章四-固定化酶的性质课件.ppt

1、四固定化酶的性质固定化常常是一种化学修饰，酶本身的结构受影响。酶固定化后其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。空间障碍扩散限制浓度梯度分配效应分配定律分配定律描述溶质在两个互不相溶的液相中的分配的定律。在一定温度和压力下，如果一种物质溶解在两个同时存在的互不混溶的液体中，达到平衡后，该物质在两相中的浓度比等于常数：(一)固定化后酶活力的变化多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30，而对低分子底物苯酞精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所

2、以，一般认为高分子底物受到空高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大间位阻的影响比低分子底物大。酶活低的可能原因酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。酶活反而高的原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶的稳定性。(二)固定化对酶稳定性的影响稳定性实际应用大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加。Merlose选择50种固定化酶测试稳定性 稳定性提高方面:热稳定性

3、提高保存稳定性好对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。对不同pH稳定性提高A 热稳定性B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。C pH稳定性青霉素酰化酶在不同pH的缓冲液中于37保温16h测定酶活力固定化酶在pH 5.5-10.3活力稳定；游离酶则仅在pH7.0-9.0稳定。固定化酶的pH稳定性明显优于游离酶。固定化后酶稳定性提高的可能原因固定化后酶分子与载体多点连接可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。抑制酶的自

4、降解。将酶与固态载体结合，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。(三)固定化酶的最适温度变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。固定化后，酶热稳定性提高，最适温度随之提高。例如，汤亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80，比固定化前提高了30。固定化后也可能降低固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的影响。(四)固定化酶的最适pH变化1、固定化后最适pH升高了2、pH稳定性增强最适pH偏移的原因载体带电荷影响酶所在微环境微环境结果带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。产物对最适pH的影响主

5、要是由于固定化载体成为了扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定限制。+催化反应产物为酸性（H+），则最适pH比游离酶高（需OH-中和）反之则偏低，中性则不变。（五）底物特异性由于存在空间位阻，可能不再作用于分子量较大的底物，只对小分子量底物有效。例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右。五 影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质。 酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化;载体的影响.由于在固定化酶的周围，形成了能对底物

6、产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。酶固定化后发生的性质变化.上述几种影响因素综合作用的结果。载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。六酶固定化载体材料研究新进展酶固定化载体材料研究新进展1磁性高分子微球磁性高分子微球磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物) 的超细粉末, 而具有磁响应性的高分子微球.作为载体的优点(1) 固定化酶从反应体系中分离和回收简便。对于双酶体系, 当一种酶失活时, 可以用磁性材料再固载另一种酶, 回收后反复使用。(2) 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中, 可以减少反应体系中的操作,

7、适合大规模连续化生产。(3) 利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶的运动方式和方向, 替代传统的机械搅拌, 提高固定化酶的催化效率。合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流体存在下进行聚合反应, 均可得到纳米级的磁性微球2 其它新型载体导电聚合物导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶电极类生物传感器的制备。光敏性单体聚合物光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶时, 条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。N - 异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到温敏性水凝胶载体, 用于固定嗜热菌蛋白酶时可实现均相催化和异相分离的统一4.3 固定化

8、细胞固定化细胞 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。这是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。固定化细胞比固定化酶优越点固定化细胞保持胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统，这对于多步催化转换，如合成干扰素等，其优势更加明显，而且无需辅酶再生。还可固定化增殖细胞.固定化增殖细胞优点固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；发酵稳定性好，可以较长时间反复

9、使用或连续使用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续生产；发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量等。固定化细胞的缺点利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用;载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性一、固定化细胞分类分类方式固定化细胞细胞类型微生物细胞植物细胞动物细胞生理状态死细胞完整细胞、细胞碎片、细胞器活细胞增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞固定化死细胞固定化死细胞一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化

10、的反应。固定化活细胞 固定化静止细胞和饥俄细胞固定化静止细胞和饥俄细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。固定化生长细胞固定化生长细胞又称固定化增殖细胞固定化增殖细胞是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。更适合于进行多酶顺序连续反应。二、固定化细胞的制备固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞的固定化。可采用微生物自身的絮凝能力来制备无载体固定化细胞。要求保持高的活力保留和具有操作稳定性。几种方法的特点 化学法化学法(共价交联共价交联)涉及菌或细胞的化学修饰。由于所用化学药品的毒性，可引起细胞破

11、坏。因此，反应耍在尽可能温和的条件下进行。在使用中细胞间、细胞和载体间的键不易被底物或盐所破坏，操作稳定性高。 吸附螯合法吸附螯合法条件温和、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱，操作时细胞易从载体脱落，特别是底物分子量高，介质的离子强度和pH变化情况下更是如此，所以操作稳定性差，但优点是可再生。包埋法包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多，且这类方法只适于小分子底物。要固定活细胞、增殖细胞，显然包埋法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。交联法交联法没有良好机械强度所以不适于实际应用。但可得到高细胞浓度，大多数情况难于再生。三、固定化细

12、胞的重要发展方向-基因工程菌的固定将基因工程和酶工程相结合，有可能使大规模培养过程中重组菌的稳定性问题得到较好解决。固定化工程菌和游离工程菌相比较，固定化细胞具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、稳定性好等特性。4.4 固定化原生质体固定化细胞缺点:只能用于生产胞外产物由于载体的影响产物和底物的扩散受到影响. 溶解氧的传递和输送受到影响.去除细胞壁障碍就可得到许多胞内产物,减少障碍.原生质体:去除细胞壁后的植物或其它生物细胞.原生质体缺点就是更脆弱,但用载体固定化后就具有高的稳定性,又比正常细胞少了胞壁障碍.4.5固定化酶和固定化细胞的表征一、评价固定化酶(细胞)的指标1.固定化酶(细胞)的活力2

13、.偶联率及相对活力的测定3.固定化酶(细胞)的半衰期1固定化酶(细胞)的活力固定化酶(细胞)的活力即是固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。固定化酶(细胞)的单位可定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为molmin-1mg-1。如是酶膜、酶管、酶板则以单位面积的反应初速度来表示即molmin-1cm2。表示固定化酶的活力一般要注明下列测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的于燥条件、固定化的原酶含量或蛋白质含量及用于固定化酶的原酶的比活力。测定方法活力可在两种基本系统填充床或均匀悬浮在保温介质中进行

14、测定。间歇测定在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下(如均匀悬浮于保温的介质中)进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。如搅拌速度过快会由于固定化酶破碎而造成活力上升。连续测定 固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力(酶的形状可能影响反应速度)。在实际应用中，固定化菌不一定在底物饱和条件下反应，故测定条件要尽可能与实际工艺相同，这样才能利于比较和评价整个工艺。2 偶联率及相对活力的测定用于表征影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活. 固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活

15、力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分数。活力回收固定化酶总活力加入酶的总活力x100偶联率(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)加入蛋白活力x100相对活力固定化酶总活力(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)x 100活力回收活力回收也可称为有效系数、活力保留百分数、偶联效率，它表示影响酶固有性质诸因素的综合效应。 静态有效系数()是在起始速度条什下测得的活力回收。操作有效系数()是在生产设备所要求的条件下测量的，是固定化酶制剂实用性的最有效数据之一。 (或)1表示反应控制良好，固定化或扩散引起的酶活力损失不明显(这种可能性不大)。 (或)1表示固定时有损失，扩散限制有影响。 (或)1可能

16、发生在个别情况。原因可能是固定化活细胞的增殖或抑制因素的排除。 3固定化酶(细胞)的半衰期固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。固定化酶(细胞)的操作稳定性是影响实用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。 在没有扩散限制时，固定化酶(细胞)活力随时间成指数关系，半衰期t1/2 0.693KD 式中KD -2.303t X lg (EE0)称为衰减常数，其中EE0是时间t后酶活力残留的百分数。二、载体活化程度和固定化配基密度的测定用不同的方法活化不同的载体材料后，载体表面活化基团的密度可能有很大差别。因而能偶联

17、配基的量也不同。活化水平从每个聚苯乙烯微球偶联几个微摩尔的基团到每毫升交联琼脂糖偶联几百个微摩尔基团。配基分子密度太低，作用有限；相反，配基密度过高可能产生非持异结合作用或者造成靶分子的洗脱困难。4.6 固定化酶及细胞的应用可用于生物大分子的固相合成和序列分析、亲和分离、同相免疫分析、载体药物及试剂、生物反应器及生物传感器等领域。主要的工业产品固定化葡萄糖异构酶放线菌固定化酶606515min一、生物化学及分子生物学基础研究固定化酶进行反应可操作性强，可用于酶的结构与功能的研究、多亚基酶及多酶体系组装方式的研究及凝血及血栓溶解的生化过程研究等。利用固定化酶 相界面催化反应的特点，还可用它来复制

18、酶膜的模型。将多酶系统包埋于微囊内，可用于酶系统的组装、定位及代谢的研究等。一)酶的结构与功能研究酶亚基性质的研究醛缩酶有4个亚基，亚基不易分离，但可控制条件使酶分子只有一个亚基通过共价键与CNBr活化的琼脂糖凝胶结合。当用浓度为8mol儿的尿素使蛋白变性后未固定的亚基被透析除去，只有固定化的亚基保留，这样就可对单亚基进行研究.实验结果说明该亚基具活力说明该亚基具活力二、工业应用1 拆分氨基酸氨基酸的光学拆分例如，将合成法制得的DL型氨基酸的N酰化衍生物，用氨基酸酰化酶进行不对称水解，然后再利用生成的L氨基酸与N酰化D氨基酸的溶解度之差分离出来。用这种方法可制得光学纯度好、收率高的L氨基酸固定

19、化方法选择将酶固定在DEAE葡聚糖等阴离子交换柱载体上。其活力回收、稳定性等比较高。具体做法：将DEAE交联葡聚糖A-25(0H型)加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，37下搅拌5h，酶吸附在DEAE-Sephadex上，洗去未结合酶，即可得到固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶柱非常稳定。在50条件下可连续使用30天，保持60一70活力。当酶柱活性下降时，可补加相应数量酶液进行简单再生对提高酶的经济效果非常有利。且DEAE交联葡聚糖载体也非常稳定，使用期达5年，酶的吸附力、形状、压力损失等不发生变化。2. 生物转化葡萄糖果糖 丹麦NovoZymes公司生产的固定化葡萄

20、糖异构酶 “Sweetzyme ”有多种型号，它是由凝结芽抱杆菌的完整细胞经过凝聚、戊二醛交联、干燥、过筛等步骤制得，其最适温度为80，最适pH为8.0-8.2，在61使用时，其半衰期1650h。生产能力为2000一3000kg干糖浆1kg固定化酶。最新一代Sweetzyme IT产品是由筛选的链霉素菌种产生的。新的Sweetzyme IT的主要优势在于：在适宜的工业条件下，每公斤酶可产出约18,000 kg 的糖浆以干物料计，并增加活力及降低糖浆副产物的形成。链霉菌属葡萄糖异构酶Sweetzyme IT的固定化过程基本上和凝结芽子包杆菌属葡萄糖异构酶Sweetzyme Q一样。布氏增基离心细

21、胞浓集物质，而细胞会因使用Manton-Ganlin均化器中的单一均化阀抽干浓集物而崩裂,压力下降到300-350kg/cm细胞与戊二醛键结用阳离子絮凝剂稀释和凝聚以给出清晰的水相过滤轴式挤压机进行挤压颗料在液相干燥器中干燥并过滤.在300-1000微米大小以用于固定化器操作中。 三、医疗方面的应用酶制剂已在临床上取得有效应用，并逐渐发展用酶治病的酶疗法。酶本身是一种蛋白质，进入人体后产生抗体，能引起患者过敏性休克。酶不稳定，易失活，进入人体后在蛋白酶作用下易被水解而失去治疗作用。制成固定化酶，稳定性增加，不被蛋白酶水解，又不与机体直接接触，可避免产生抗体，因而为酶治疗开辟了前景。将酶包埋在半

22、透膜性质的聚合物内，即可制得微小胶事囊型固定化酶。胶囊型酶使囊外蛋白酶、抗体等不能进入囊内部接触，所以在利用其来治病时，不会在患者体内产生抗体，避免过敏性反应。L天门冬酰氨酶是第一种用于治疗癌症的酶类药物但天然的L门冬酰胺酶进入人体会产生抗体，出现休克如制成固定化酶可避兔上述抗体反应。将尼龙薄膜制成微囊型固定化酶，或用硝酸纤细素微囊化再与戊二醛交联用于治疗小白鼠白血病，与对照组相比，疗效明显。四、诊断、分析方面的应用酶的专一性可以便酶在一个复杂体系中，不受其他物质千扰，准确地测出某一物质含量。目前国外已普遍将酶学分析法应用于化学分析和临床诊断等方面。实践证明酶学分析法具有灵敏度高、专一性强等优

23、点。近来已发展成为快速、准确、灵敏、自动化的分析方法。1酶试纸的应用将酶固定于纸片上，制成能测定某些物质的含量的试纸，用于诊断，非常简便、迅速。尿糖试纸尿糖试纸(葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶）葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶）2酶柱固定化酶装入柱内，让样品通过酶柱后，用光化学或电化学方法测定流出液中底物的减少、产物的增加或辅助因子的变化 3酶管 将酶直接共价结合于内径1mm、长3m的尼龙管或聚苯乙烯管内壁，当待测溶液通过酶管后，生成的产物可以在自动分析系统中连续测定。目前已制成脲酶、葡萄糖氧化酶等酶管。国外已制成多种酶管自动分析仪，作为商品出售。其优点在于可连续、快速、自动地测定微量样品。 4酶电极 酶电极可能是固定化酶当前研究和应用最活跃的领域之一，它使酶分析进展到高度简便化、自动化、微型化和连续化。目前常用的几种酶电极有：脲酶电极测定尿素、葡萄糖氧化酶电极测定葡萄糖、乳酸脱氢酶电极测定乳酸、青霉素酶电极测定青霉素等。五、环境保护方面的应用1环境监则 根据固定化酶用于化学分析的原理，固定化酶(细胞)也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。2。处理工业废水 以往人们利用活性污泥来处理污水。现在人们尝试从活性污泥中分离出微生物，然再后将其固定，由此组成快速、高效，能连续处理工业污水的系统。