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1、第三章第三章 质谱技术质谱技术Mass spectrumMS内容：内容：第一节第一节 质谱学基础质谱学基础第二节第二节 高效液相色谱质谱联用高效液相色谱质谱联用第三节第三节 生物质谱简介生物质谱简介第一节第一节 质谱学基础质谱学基础 什么是质谱质谱仪的基本结构 质谱仪的主要性能指标 质谱图及其判读第二节第二节 高效液相色谱质谱高效液相色谱质谱 (HPLC-API MS) HPLC-ESIMS(电喷雾电离电喷雾电离) HPLC-APCI(大气压化学电离大气压化学电离) LCMS联用所面临的两大问题联用所面临的两大问题液相色谱流动相的量比质谱所能忍受的量大得多。典型流量是1mL/min,气化后相当

2、于气体流速1501200mL/min，而现代质谱只能忍受的气体流量只有120mL/min；液相色谱的研究对象是难挥发和热不稳定的化合物，这些化合物用常规电离方法是很难电离的。关于LCMS的研究主要致力于解决上述两个问题。LC/MS 电离技术的相对适用性电离技术的相对适用性 HPLC-ESIMS (电喷雾电离电喷雾电离) 检测器检测器喷雾室喷雾室离子阱离子阱加热的氮气干燥气加热的氮气干燥气双电子毛细管入口双电子毛细管入口 雾化气雾化气(气体用红色显示气体用红色显示)溶剂喷雾溶剂喷雾+电喷雾电喷雾离子离子-4000 V 电喷雾电离源API-Electrospray Ion Source高电压装置高

3、电压装置电喷雾电离离子形成的必要步骤电喷雾电离离子形成的必要步骤 步骤步骤 1 溶液中的电离溶液中的电离 样品的样品的pKa 溶液的溶液的pH步骤步骤 2 喷雾喷雾表面张力和粘度表面张力和粘度气动辅助气动辅助步骤步骤 3 去溶剂去溶剂干燥气温度和流速干燥气温度和流速热容量，热容量，H vap步骤步骤 4 离子从溶液中解吸离子从溶液中解吸溶解能溶解能步骤步骤 5 气相中的离子反应气相中的离子反应质子亲合力质子亲合力电荷交换电荷交换步骤 1在溶液中如何产生离子？在溶液中如何产生离子？离子种类离子种类 NH4+ PO4-酸酸/碱化学性质碱化学性质 M - NH2 + 酸酸 M - NH3+ + 酸酸

4、-（正离子检测）（正离子检测） M - COOH + 碱碱 MCOO- + 碱碱+ （负离子检测）（负离子检测）缔合缔合（对类似糖的中性物质） M + Na+ M - Na+ （碱金属，如（碱金属，如20 m mM 乙酸钠）乙酸钠）衍生化衍生化 形成离子或酸形成离子或酸/碱产物碱产物 步骤 2气动辅助电喷雾产生带电液滴含有约100,000电荷、直径2 m mm的带电溶剂液滴由于溶剂组成或流速，气动喷雾减小了液滴的大小对粘度和表面张力的偏离喷雾柱体、端板和毛细管上的场使液滴带电步骤 3带电液滴的去溶剂热干燥气体加热的氮气蒸发了液滴，增加了电荷/体积比。Rayleigh极限是带电液滴能够存在的最大

5、 电荷/体积比 。当电荷超过这个极限时，发生库仑破裂。液滴的液滴的ContCont库仑分裂库仑分裂 Rayeigh破裂释放出较小的最终变成样品离子的液滴。50-100 nm带电液滴包含100个电荷 这些液滴包含母体液滴中10-20%的电荷但仅仅2 %的质量。步骤步骤 4 4从溶液中解吸离子从溶液中解吸离子当液滴的场强超过分析物在溶液中的溶解能时，离子解吸进入气相。带电残余物离子蒸发蒸发蒸发Rayleigh极限极限Coulomb爆裂爆裂蒸发蒸发被分析离子被分析离子步骤 5气相中的离子反应通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转移和电

6、荷交换反应。这个高压区允许发生移和电荷交换反应。这个高压区允许发生1000次离子次离子/分子分子反应。反应。 质子转移: 气相质子转移反应使分子带电 M + NH4+ M+H+ + NH3帽电压帽电压裂解区裂解区雾化气压力雾化气压力干燥气干燥气温度和流速温度和流速雾化气压力雾化气压力800 mL/min 50-70 psig干燥气流速干燥气流速 (6-12 L/Min)含水高需更高的流速如果太底，液滴会导致谱图中的尖峰当有疑问时，使用过量的干燥气温度干燥气温度蒸汽压越低的溶剂温度越高 开始为 300 - 350C帽电压帽电压 用FIA优化 (2000-5000) 开始 3000 V 在负离子模

7、式，注意高的室电流或兰色光辉（电晕针显示）：当这现象发生时须降低帽电压电喷雾喷雾室设置电喷雾喷雾室设置样品样品 在溶液中为离子态: 儿茶酚胺、硫酸酯共轭物、丁基胺 有可诱导电离的化合物：甲醇 含杂原子的化合物：氨基甲酸酯类，苯并二氮杂草类 溶液中带多电荷：蛋白质、多肽、低聚核甘酸溶液化学参数溶液化学参数 流速 样品的 pK, 溶液 pH 溶液导电性应避免的样品应避免的样品 尤其非极性的样品：PAHs, PCBs电喷雾需考虑的问题电喷雾需考虑的问题溶剂+ H+ + A 溶剂 + A + H+雾化蒸发液滴气相电离HPLC-APCI(大气压化学电离大气压化学电离)APCIAPCI离子化机理离子化机理

8、VcapCorona currentNebulizerPressureFragmentor Drying gasTemperatureand FlowHeaterAPCI离子化机理离子化机理 气化气化 溶剂电离溶剂电离 电荷交换给分析物电荷交换给分析物 N2 (从干燥气) + e- N2+ + 2e- N2+ + 2N2 N4 + + N2 N4+ + H2O H2O + + 2N2H2O + + H2O H3O+ + OH H3O+ + M M+H+ + H2OAPCI 离子源电晕针 HPLC 流速流速 500m mL/min 雾化气压力雾化气压力60 psig 干燥气温度干燥气温度star

9、t with 350 C干燥气流速干燥气流速4 L/min气化温度气化温度随 FIA调节帽电压帽电压随 FIA调节 (2000-6000)开始 2500 V电晕电流电晕电流随 FIA调节开始 25 A (neg) 或 4 A (pos)帽电压帽电压电晕针电晕针电流电流雾化气雾化气压力压力碎裂区碎裂区 干燥气干燥气温度和流速温度和流速加热器加热器APCI 喷雾室的设置喷雾室的设置样品样品 分子量和极性中等的化合物：PAHs, PCBs, 脂肪酸, 邻苯二甲酸酯类； 不含酸性和碱性位点的化合物（碳氢化合物、醇、醛、酮和酯）； 含有杂原子的化合物：脲、苯并二氮杂草、氨基甲酸酯； 具有一定挥发性的化合

10、物, 排除了分子量较大和极性较大的分子, 如蛋白质/多肽； 电喷雾响应不好的样品；溶液化学参数溶液化学参数 较ES对溶液化学作用不灵敏 较ES更耐大的流速 适用ES不宜的一些溶剂应避免的样品应避免的样品 在气化过程中热不稳定的化合物APCI APCI 需考虑需考虑 电喷雾电离电喷雾电离: 其电离过程通过电场产生带电液滴，接着样品离子通过离子蒸发后，进行质谱分析。适用于在溶液中为离子态或可诱导电离的化合物。适用于分子量较大和极性较大的分子, 如蛋白质/多肽； 大气压化学电离大气压化学电离(APCI): 气相化学电离 (CI)过程中溶剂相当于CI反应气来使样品电离。适用于分子量和极性中等的化合物和

11、具有一定挥发性的化合物, 排除了分子量较大和极性较大的分子。小小 结结HPLCHPLCMSMS用途用途 成份确认或定性及半定量，如合成产物分析，成份确认或定性及半定量，如合成产物分析，FIA 无光谱吸收物质的定量无光谱吸收物质的定量 低含量和色谱未分离成份的测定，如杂质检查，低含量和色谱未分离成份的测定，如杂质检查，SIM，LC条件优化条件优化 未知样品的分析，如中药分析，与未知样品的分析，如中药分析，与DAD结合结合, Multi-channel data acquisition 大分子大分子样品分析，样品分析，pH至关重要至关重要样品前处理样品前处理质谱检测条件质谱检测条件检测离子模式，离

12、子化参数设定检测离子模式，离子化参数设定液相色谱条件液相色谱条件ESI液质分析液质分析APCI液质分析液质分析样品导入方式样品导入方式Infusion, HPLC, FIA柱后修饰技术柱后修饰技术样品前处理样品前处理q 了解样品情况了解样品情况 种类种类 纯度或含量，溶解度，存储条件，挥发性，纯度或含量，溶解度，存储条件，挥发性， 热稳定性热稳定性 分子结构，分子结构，pK值，值，pI值值q 影响影响LC/MS分析的主要因素分析的主要因素 盐盐 背景或基质成份背景或基质成份(离子化离子化) 浓度浓度 ng/ml, dimer 真空度，溶剂雾化真空度，溶剂雾化质谱条件质谱条件 - - 离子源选择

13、（离子源选择（1 1）ESI待测物无需有挥发性待测物无需有挥发性热不稳定成份首选热不稳定成份首选离子在溶液中已形成离子在溶液中已形成形成单电荷离子和多电形成单电荷离子和多电荷离子荷离子流速流速 750500500L/minL/min质谱条件质谱条件 - - 离子源选择（离子源选择（2 2）ESIESI在溶液中已是离子态在溶液中已是离子态lcatcata acholaminescholamines, sulfate , sulfate conjugates, quaternary conjugates, quaternary aminesamines含杂原子化和物含杂原子化和物lcarbamat

14、escarbamates, , benzodiazepinesbenzodiazepines带多电荷成份带多电荷成份lproteins, peptides, proteins, peptides, oligonucleotidesoligonucleotides对对APCIAPCI响应弱的物质响应弱的物质APCIAPCI中等分子量和中等极性成份中等分子量和中等极性成份lPAHsPAHs, PCBs, fatty acids, , PCBs, fatty acids, phthalates, alcohols, phthalates, alcohols, aldehydesaldehydes,

15、, ketonesketones，etcetc. .含杂原子化和物含杂原子化和物lcarbamatescarbamates, , benzodiazepinesbenzodiazepines对对ESIESI响应弱的物质响应弱的物质质谱条件质谱条件 - - 离子模式选择离子模式选择正离子正离子ESES模式：模式：适合于碱性样品适合于碱性样品，amines, amides, aminoacidsamines, amides, aminoacids, , antibioticsantibiotics，etcetc有杂原子有杂原子(N(N2 2 O O2 2) )可接受可接受H H+ +、NaNa+

16、+、NHNH4 4+ +，如，如NHNH2 2、 N N、 NHNH、COCO、COORCOORpH pK-2pH N N2 2) ) 可失去质子可失去质子? COOH? COOH、SHSH、NONO2 2pH pK+2pH pK+2可正可负可正可负: :比较灵敏度比较灵敏度质谱条件质谱条件 - API- API参数设定参数设定ESI For aqueous levels above 50%HPLC Flow rate (l/ml)Nebulizer Pressure (psi)Drying Gas Flow (l/min)Drying Gas Temp (0C)1-1010-15432510

17、-5015-20532550-20020-408350200-50030-508-10350500-100050-7010-12350HPLC Flow Rate (l/min)Nebulizer Pressure (psi)Drying Gas Flow (l/min)Drying Gas Temp (0C)APCI Temp (0C)*200-1500604350300-500APCI Good sensitivity at above 500l/min，* - 需优化需优化液相方法转为液质联用需要考虑：液相方法转为液质联用需要考虑：- - 色谱分离和待测物离子化色谱分离和待测物离子化 待

18、测物的离子化能力待测物的离子化能力 流动相及流速与质谱的匹流动相及流速与质谱的匹配性配性 色谱柱与质谱的匹配性色谱柱与质谱的匹配性色谱柱色谱柱流动相流动相流速流速液相条件液相条件- - 选择相应的色谱柱选择相应的色谱柱ApplicationColumn I.D.Flow RateStandard2-4mm500-2500 L/minNarrowbore1-2mm100-500 L/minMicro LC1mm800m40 L/min20 L/minCapillary LC300 m180 m4L/min2 L/minNano LC100 m 75 m 50 m300nL/min180nL/mi

19、n 80nL/min液相条件液相条件- - 色谱柱内径选择色谱柱内径选择ESIESIFlow rate: 1-Flow rate: 1-1000l/min1000l/min1.0, 2.1, 3.0mm id1.0, 2.1, 3.0mm id建议用建议用 2.1mm2.1mm浓度相关浓度相关反相流动相反相流动相APCIAPCIFlow rate: 50-1500l/minFlow rate: 50-1500l/min4.6, 3.0, 2.1mm id4.6, 3.0, 2.1mm id建议用建议用 4.6mm4.6mm浓度不相关，进样多，信号浓度不相关，进样多，信号强强反相和正相流动相反相

20、和正相流动相液相条件液相条件- - 色谱柱颗粒度选择色谱柱颗粒度选择5m Particles5m Particles扫描模式扫描模式 wider peak widthwider peak width简单样品简单样品3.5m or 3.5m or 3000 对目标预期分子量选择加合离子和参数对目标预期分子量选择加合离子和参数选择反卷积参数蛋白质分子量 3000选择反卷积参数概要点击点击反卷积反卷积质谱图（质谱图（ Deconvolute - Mass Spectra ）在谱图中找到多电荷成分）在谱图中找到多电荷成分反卷积Results点击点击反卷积反卷积查看（查看（ Deconvolute -

21、view ）得到结果的详细列表）得到结果的详细列表反卷积查看结果Detailed list在在反卷积反卷积电荷状态标尺（电荷状态标尺（ deconvolution-charge state ruler ）下选择可以手动）下选择可以手动反卷积反卷积所选择的质谱图所选择的质谱图选择加合离子子和所需电荷状态选择加合离子子和所需电荷状态反卷积手动步骤1 移动至电荷状态（移动至电荷状态（15），点击鼠标左键），点击鼠标左键反卷积手动步骤2 分子量分子量以m/z值、电荷状态和加合离子计算分子量 平均质量平均质量平均反卷积中找到的所有信号的化合物质量值进行 Pred峰（平均）峰（平均）除以平均质量和电荷值，加上加合质 量计算 化合物质量化合物质量计算（实际峰加合离子）x电荷 电荷电荷质谱图中实际峰的电荷状态理解反卷积的详细结果