毛细管电泳.课件.ppt

1、第四组：第四组： 周毅周毅 龙城龙城 陈欣陈欣ContentsContents一、概述一、概述二、经典电泳分析二、经典电泳分析三、毛细管电泳分析法三、毛细管电泳分析法 毛细管电泳，又叫高效毛细管电泳（毛细管电泳，又叫高效毛细管电泳（HPCEHPCE），是八十），是八十年代问世的一种高效的液相分离方法，是经典电泳技年代问世的一种高效的液相分离方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。术和现代微柱分离相结合的产物。 毛细管电泳有六种不同的分离形式可供选择，具有分毛细管电泳有六种不同的分离形式可供选择，具有分析时间短，分离效率高等特点。广泛用于分离多种化析时间短，分离效率高等特点。广泛用于分离

2、多种化合物，如氨基酸、糖类、维生素、神经递质、合物，如氨基酸、糖类、维生素、神经递质、DNADNA片片段等。毛细管电泳在食品分析、药物分析和生命科学段等。毛细管电泳在食品分析、药物分析和生命科学等领域得到了广泛应用。等领域得到了广泛应用。二、经典电泳分析二、经典电泳分析利用利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫的方法和技术叫电泳法电泳法或或电泳技术电泳技术。 按按形状分类：形状分类：U U型管电泳、柱状电泳、板电泳；型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、

3、自由电泳；电泳、自由电泳； 传统传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比难，无法与其他分析相比。三、高效毛细管电泳分析三、高效毛细管电泳分析高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1、采用了内径在、采用了内径在25100 m，外径，外径300400 m的毛细的毛细管管2、采用了高达数千伏的电压、采用了高达数千伏的电压（1）毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大）毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高减小了温度效应，使电场电压可以很高（2）电压升高，

4、电场推动力大，又可进一步使柱径变）电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加小，柱长增加（3）高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理）高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万米，特殊柱子可以达到数百万1 1、毛细管电泳基本原理毛细管电泳基本原理 毛细管电泳中，带电粒子的运动受到两种作用：毛细管电泳中，带电粒子的运动受到两种作用：电泳和电渗电泳和电渗。 电泳电泳是指溶液中带电粒子是指溶液中带电粒子(离子、胶团离子、胶团)在电场中在电场中定向移动的现象，是驱动毛细管中电解质运动的定向移动的现象，是驱动毛细管中电解

5、质运动的一种作用力。一种作用力。 电渗电渗是在电场的作用下，毛细管中的溶液表层聚是在电场的作用下，毛细管中的溶液表层聚集的正电荷向负极运动的现象。集的正电荷向负极运动的现象。（1 1）分离过程）分离过程 电场作用下，毛细管柱中出现：电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的带电粒子的迁移速度迁移速度=电泳电泳+电渗流电渗流；两种速度的矢量和。；两种速度的矢量和。 正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；受电渗流影响，在阳离子后流

6、出； 阴离子阴离子：两种效应的运动方向相反。：两种效应的运动方向相反。电渗流电渗流电泳时电泳时,阴离阴离子在负极最后流出。子在负极最后流出。（2 2）迁移速度）迁移速度 当带电离子以速度当带电离子以速度在电场中移动时，受到大小相等、在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE = qE 阻力：阻力：F = f 故：故：qE= fqq离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E E 电场强度；电场强度；离子在电场中的迁移速度；离子在电场中的迁移速度；f f 平动摩擦系数平动摩擦系数( ( 对于球形离子：对于球

7、形离子：f =6f =6；离子的表观液态动力学半离子的表观液态动力学半径；径；介质的粘度；介质的粘度；) ) （3 3）电渗流现象）电渗流现象 液体两端施加电压时，会发生液体相对于固体表面的液体两端施加电压时，会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗电渗现象现象。 电渗是电渗是CECE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的近似扁平型的“塞式流塞式流”。它使溶质区带在毛细管内。它使溶

8、质区带在毛细管内原则上不会扩张。原则上不会扩张。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。 电渗流的大小用电渗流速度V电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。 V电渗流= E 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极 Eg：石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；2 2、高效毛细管、高效毛细管电泳分离模式电泳分离模式 毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)(CZE)1 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CZE) (CZE) 2胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKCMEKC）3 毛细管等速电泳毛细管等速电泳

9、（CITFCITF）5毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦(CIEF)(CIEF)4毛细管电色谱毛细管电色谱（CECCEC）6 毛细管区带电泳毛细管区带电泳（CZECZE） CZE CZE 是使用裸毛细管和真溶液性质的电解质缓冲溶液进是使用裸毛细管和真溶液性质的电解质缓冲溶液进行的毛细管电泳技术，是毛细管电泳中应用最广泛、最行的毛细管电泳技术，是毛细管电泳中应用最广泛、最基本的一种分离模式基本的一种分离模式。 分离机理分离机理是基于各被分离组分的是基于各被分离组分的荷质比荷质比之间的差异之间的差异。 通常把通常把CZE CZE 看成其他各种毛细管电泳分离模式的母体。看成其他各种毛细管电泳分离模式的母体

10、。 应用范围应用范围包括氨基酸、多肽、蛋白质、离子、对映体拆包括氨基酸、多肽、蛋白质、离子、对映体拆分和很多其他本身能带电或在一定条件下能带上电荷物分和很多其他本身能带电或在一定条件下能带上电荷物质的分离。质的分离。 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳（CGECGE） CGE CGE 是以凝胶或高浓度线性高分子溶液为介质填充在毛细是以凝胶或高浓度线性高分子溶液为介质填充在毛细管内而进行的电泳。被分析组分因电泳而迁移，在迁移过管内而进行的电泳。被分析组分因电泳而迁移，在迁移过程中依据分子的大小在起程中依据分子的大小在起“分子筛分子筛”作用的凝胶中得以分作用的凝胶中得以分离。离。 特点特点：抗对流性好，

11、散热性好，分离度极高抗对流性好，散热性好，分离度极高。 因为蛋白质、因为蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/ /质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模式很难分离，采用模式很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，所以是能获得良好分离，所以是DANDAN排序排序的重要手段。的重要手段。 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKCMEKC） MEKC MEKC 采用临界胶束浓度以上的采用临界胶束浓度以上的表面活性剂表面活性剂在运行缓冲液在运行缓冲液内形成疏水内核、外部带负电的动态胶束假固相，利用内形成疏水内核、外部带负电的动态胶束假固相，利用溶溶质的疏水性差异质的疏水性差

12、异，在溶液和胶束假固相间分配的差异进行，在溶液和胶束假固相间分配的差异进行分离。分离。 不仅能分离中性溶质，而且能分离带电组分不仅能分离中性溶质，而且能分离带电组分。此此表有助于表有助于根据样品的根据样品的物化性质选物化性质选择合适的电择合适的电泳模式泳模式。3 3、高效毛细管电泳的特点、高效毛细管电泳的特点1 1. . 仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2. 2. 分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min3.1min内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min4.1min内分内分离了

13、离了2424种阳离子；种阳离子；柱柱效常常可达效常常可达10105 5-10-106 6理论塔极数理论塔极数/ /米米；3. 3. 操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，进样量极少，每次进样的体积仅为每次进样的体积仅为1mL10nL1mL10nL4. 4. 应用范围极广应用范围极广 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等4 4、毛细管电毛细管电泳的应用泳的应用 药物分析 手性化合物分析 离子分析 核酸分析及DNA测序毛细管电泳电化学发光 分离检测技术 毛细管电泳离子色谱检测离子药物分析药物分析 CE 对药物及其制剂的成分分析对药物及

14、其制剂的成分分析，主要主要用于新药研究和开发用于新药研究和开发、药品、药品生产生产过程中的质量控制过程中的质量控制、药物制、药物制剂剂分析分析等。等。 采用毛细管区带电泳方式，在采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离内分离17种药物；种药物；eg：采用：采用MEKC模式，鉴定违禁模式，鉴定违禁药药物；效果物；效果优于优于HPLG法。法。手性化合物分析手性化合物分析 合成获得单一手性化合物相当困难，检测分析更是相合成获得单一手性化合物相当困难，检测分析更是相当困难；当困难； HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂加入手性选择剂； 常用手性选择剂：环

15、糊精及其衍生物；手性冠醚；手常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、低聚糖等天然手性表性表面活性剂（氨基酸衍生物、低聚糖等天然手性表面活性剂）面活性剂）离子分析离子分析阳离子分析阳离子分析： 迁移方向和电渗流方向一致；迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min4.5min内分离了内分离了2424种金属离子种金属离子 阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度；阴离子分析：阴离子分析： 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近；阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近； 分析时间长、效率低；分析时间长、效率低； 阴极进样，阳极检测

16、；阴极进样，阳极检测； 但是质量小、电荷密度大的离子如但是质量小、电荷密度大的离子如SO4-2SO4-2、F-F-等，电泳速等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测； 可加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电可加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min3.1min内分离内分离3636种阴离子。种阴离子。 核酸分析及核酸分析及DNADNA测序测序 CZECZE和和MECCMECC通常用来分离碱基、核苷、核苷酸、简单通常用来分离碱基、核苷、核苷酸、简单的寡核苷酸等

17、。的寡核苷酸等。CGECGE则可用于寡核苷酸则可用于寡核苷酸( 10mers)( 10mers)、ssDNAssDNA和和dsDNAdsDNA等的分离。等的分离。 人类基因组计划所需解决的关键问题之一就是提高测人类基因组计划所需解决的关键问题之一就是提高测序的速度。如用短寡核苷酸引物库测序的速度。如用短寡核苷酸引物库测DNADNA序列、高速序列、高速DNADNA序列、毛细管阵列、毛细板阵列等。序列、毛细管阵列、毛细板阵列等。 对对DNADNA分析是分析是CECE的应用重点之一，的应用重点之一，CE-MSCE-MS联用联用也已用于也已用于DNADNA分析。分析。毛细管电泳毛细管电泳电化学发光分离

18、检测技术电化学发光分离检测技术 Ru(Ru(bpybpy) )3 32+2+ ECL ECL 技术已经成功应用于技术已经成功应用于CECE，简称，简称CE-ECLCE-ECL。 主要用来检测胺类化合物主要用来检测胺类化合物 操作简单、灵敏度高、分离效率高、分析速度快以及试剂操作简单、灵敏度高、分离效率高、分析速度快以及试剂消耗少等。消耗少等。CE-ECLCE-ECL主要有四种模式：主要有四种模式： 毛细管区带电泳毛细管区带电泳-ECL(CZE-ECL)-ECL(CZE-ECL)， 胶束电动色谱胶束电动色谱-ECL(MEKC-ECL)-ECL(MEKC-ECL)， 毛细管电色谱毛细管电色谱-EC

19、L(CEC-ECL)-ECL(CEC-ECL) 非水毛细管电泳非水毛细管电泳-ECL(NACE-ECL)-ECL(NACE-ECL)。毛细管电泳离子色谱检测离子毛细管电泳离子色谱检测离子传统的毛细管电泳法主要用于检测有机大分子和蛋白质的分传统的毛细管电泳法主要用于检测有机大分子和蛋白质的分离，难以检测没有紫外吸收的无机离子。离，难以检测没有紫外吸收的无机离子。分离能力强。分离能力强。传统离子色谱柱内径传统离子色谱柱内径4-5mm，而毛细管电泳，而毛细管电泳离子色谱柱的内径为离子色谱柱的内径为5-500m，其理论踏板数为每米几十万，其理论踏板数为每米几十万到上百万，远高于传统离子色谱。到上百万，

20、远高于传统离子色谱。分离速度快。分离速度快。通常在几分钟内即可分离完全，而常规离子通常在几分钟内即可分离完全，而常规离子色谱分析一般需要几十分钟。色谱分析一般需要几十分钟。操作简便、费用低。操作简便、费用低。毛细管的价格远远低于离子色谱柱的毛细管的价格远远低于离子色谱柱的价格价格。进样量小。进样量小。一般小于一般小于100 nL， 而传统离子色谱则需而传统离子色谱则需10-15uL5 5、毛细管电泳的毛细管电泳的前景展望前景展望1 1、微型化、微型化 毛细管电泳可以实现微型化，整体化学分析系统（毛细管电泳可以实现微型化，整体化学分析系统（TASTAS）及）及TASTAS微型化微型化。2 2、联

21、、联用用仪器仪器 将将毛细管电泳毛细管电泳- -质谱技术（质谱技术（CE-MSCE-MS）结合起来）结合起来。3 3、阵列毛细管阵列毛细管凝胶电泳凝胶电泳 一一个新的进展个新的进展方向方向，目前，目前最有效的最有效的DNADNA序列分析仪，序列分析仪，若用若用100100支毛细管阵列电泳，速度可达到支毛细管阵列电泳，速度可达到280280碱基对碱基对/ /小小时时/ /支支。5 5、毛细管电泳的毛细管电泳的前景展望前景展望4 4、微全分析微全分析( (-TAS)-TAS) 使得集成毛细管电泳技术使得集成毛细管电泳技术(ICEC)(ICEC)延伸了毛细管电泳的潜延伸了毛细管电泳的潜力和可行性。力和可行性。 5 5、CECE分析分析微生物微生物 通过通过改变微生物的生存环境来改变细菌的表面特征改变微生物的生存环境来改变细菌的表面特征, , 借借助助 CE CE 方法测定其特征及其这种方法测定其特征及其这种改变改变。 人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。