转基因成分PCR定性检测技术53页PPT课件.ppt

1、2022-6-7种子转基因成分种子转基因成分PCR定性检测技术定性检测技术2022-6-72022-6-7 将不同来源的将不同来源的DNA分子进行重组，克服了天然物种生殖分子进行重组，克服了天然物种生殖隔离的屏障，将具有某种特性的基因分离和克隆，再转接到隔离的屏障，将具有某种特性的基因分离和克隆，再转接到另外的生物细胞内。转基因可以按照人们的意愿使生物体的另外的生物细胞内。转基因可以按照人们的意愿使生物体的遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存在的新的生遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。物功能和类型。 是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是是指遗传

2、物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。简称：简称：GMOs2022-6-7喷施草甘膦前喷施草甘膦后 返回抗草甘膦油菜RT73非转基因油菜2022-6-7中国培育的转基因抗虫水稻Bt632022-6-7v植物转基因方法植物转基因方法农杆菌介导转化法农杆菌介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物

3、伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。2022-6-7基因枪介导转化法基因枪介导转化法 利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪)，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。花粉管通道法花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道

4、，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于20世纪80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。2022-6-7 调控元件：启动子、终止子、内含子、增强子等；启动子、终止子、内含子、增强子等； 标记基因：hpt基因，基因，NptII基因，基因，GUS基因等；基因等； 目的基因：抗虫性状的抗虫性状的cry系列基因、系列基因、 抗除草剂性状的抗除草剂性状的EPSPS基因、基因、PAT基因、基因、BAR基因等。基因等。转入的基因转入的基因P35STerminatorIntro

5、n HSP - CryAbMon810玉米玉米其他其他 Bt 玉米玉米P35STerminator2022-6-7 转基因作物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例转基因植物在美国问世，1987被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，2019年完成安全性评价研究，2019年在美国最早开始商业化生产，当年种植面积174万公顷。 据“农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）”2019年3月7日发布的年度报告称：2019年，共有29个国家种植了1.48亿公顷转基因作物；2019年到2019年，全球转基因作物累计种植面积超过10亿公顷。 2019年中国种植转基因作物面积达3

6、50万公顷，排名世界第六，其中转基因棉花330万公顷，其余是转基因木瓜，转基因番茄，转基因辣椒等。截止目前，中国共批准发放7种转基因植物的农业转基因生物安全证书，耐贮存番茄、抗虫棉花、改变花色的牵牛花、抗病的辣椒、抗病的番木瓜、抗虫水稻、转植酸酶基因玉米。2022-6-72022-6-72022-6-72022-6-72022-6-7v 转基因检测方法分类转基因检测方法分类v 转基因成分转基因成分PCR定性检测定性检测DNA提取PCR扩增电泳及分析（生物化学测定法蛋白质分析法PCR测定法（）2022-6-7v 转基因检测方法分类转基因检测方法分类2022-6-72022-6-72022-6-7

7、2022-6-72022-6-7掌握检测对象的基本信息。如DNA或蛋白水平检测，要了解转基因植物插入的DNA序列信息及表达情况；须有针对特定核酸或蛋白的检测方法。如DNA水平检测的引物、探针和蛋白水平检测的抗体等；检测必须使用标准参考物质。作为转基因成分检测中的对照、用于制作转基因定量分析的标准曲线、不同实验室之间结果比较的重要参考。检测技术检测技术2022-6-7转基因检测工作流程转基因检测工作流程未检出未检出GMOGMO成分成分样品样品DNADNA提取提取 PCRPCR扩扩增增阳性阳性阴性阴性检出检出GMOGMO成分成分电泳分析电泳分析2022-6-7检测步骤检测步骤vDNADNA提取提取

8、vPCRPCR扩增扩增v电泳分析电泳分析2022-6-7vDNA提取2022-6-72022-6-7vPCR扩增检测基因检测基因引物引物引物序列引物序列 (5-3)PCR产物大小产物大小(bp)SPSPrimer1Primer2SPS-F1: TTGCGCCTGAACGGATATSPS-R1: GGAGAAGCACTGGACGAGG277CaMV 35SPrimer1Primer235S-F1: GCTCCTACAAATGCCATCATTGC35S-R1: GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC195NOSPrimer1Primer2NOS-F1: GAATCCTGTTGCCGGTC

9、TTGNOS-R1: TTATCCTAGTTTGCGCGCTA180BtPrimer1Primer2Bt-F1: GAAGGTTTGAGCAATCTCTACBt-R1: CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT3013011 1、引物：、引物： 用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水将引物稀释到10 mol/L。 引自农业部953号公告620192022-6-72 2、设置对照、设置对照 在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 设置两个阴性对照：用非转基因玉米材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板； 设置两个阳性对照，用转Bt基因玉米含量为1%的玉米DNA作为PCR反应

10、体系的模板； 设置一个空白对照：用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板 2022-6-73 3、反应体系制备、反应体系制备1 1）体系制备。）体系制备。一组样品 (包括样品/阳性/阴性/空白对照)的体系要一起制备，每个试样2次重复。取1.5ml离心管，按照表A.2给出的顺序依次加入试剂。在配制反应体系时所有的试剂都应置于冰上。用移液器轻轻混合反应体系并轻微轻微离心！离心！ 2022-6-7PCR反应体系（不包含模板DNA）试剂试剂终浓度终浓度单样品体积单样品体积 10样品体积样品体积ddH2O14.375 l143.75 l10PCR 缓冲液缓冲液12.5 l25l25 mmol/L MgCl2

11、2.5 mmol/L2.5 l25 ldNTPs0.2 mmol/L2 l20 l10 mol/L Primer 10.5 mol/L1.25 l12.5 l10 mol/L Primer 20.5 mol/L1.25 l12.5 l5 U/l Taq 酶酶0.025 U/l0.125l1.25l总体积总体积24 l240 l注：注：PCR缓冲液中有缓冲液中有Mg2+的，不应再加的，不应再加MgCl2。2022-6-72 2）分装：）分装：根据需扩增的样品数量取0.2ml离心管，分别编号，将配制好的反应混合物分装在0.2ml离心管中，每管24l；然后在每管中加入DNA模板，盖上盖子，弹去气泡，

12、短暂离心使液体置于离心管底部。3 3）加入）加入DNA DNA 模板。模板。在上面的分装液中加入1l 25 ng/l DNA 模板。轻轻振荡并轻微离心，再加约50 L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。2022-6-74 4、PCRPCR反应程序反应程序 离心10 s后，将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：95变性5 min；进行35次循环扩增反应（94变性1 min，56退火30 s，72延伸30 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72延伸7 min；4保存。（SPS、35S、NOS、Bt均使用相同的反应程序。）反应结束后取出PCR反应管，加入约3l的

13、加样缓冲液，混匀备用。 2022-6-72022-6-7v电泳及分析1、琼脂糖凝胶电泳2、结果分析3、异常情况分析2022-6-71 1、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。1）琼脂糖： 根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。2022-6-72 2）凝胶浓度选择：）凝胶浓度选择：琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.

14、961.50.232.00.12琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围2022-6-73）电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）TBE与与TPE：缓冲容量高，：缓冲容量高，DNA分离效果好，但分离效果好，但TPE在在DNA片段回收时含磷片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使酸盐浓度高，容易使DNA沉淀沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止酶的活性

15、，防止PCR扩增产物降解扩增产物降解2022-6-74）上样缓冲液（ Loading buffer ）： 一般由水、蔗糖和染料 (例如：二甲苯胺、溴酚蓝、溴甲酚绿等) 组成。 DNA 样品首先要与上样缓冲液混合，才能加入凝胶中电泳。 DNA 样品的最大上样量根据片段的数量而定。在0.5 cm 宽的条带中，能被凝胶成像仪检测到的溴化乙锭染色的DNA，最小量约为的2 ng。如果含有超过500 ng 的DNA，导致拖尾。 上样缓冲液有以下3 个作用：l增加样品的密度保证DNA 均匀加入到点样孔中；l使样品着色，以简化点样过程；l在样品中加入染料，能使其在电场中以可预见的速率移动。 2022-6-75

16、）琼脂糖电泳的染色剂v最常用的染色剂：最常用的染色剂：溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 极强的诱变剂/致癌物质，有慢性毒性。在操作时必须戴手套。Gold View 一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。较为安全。2022-6-76）DNA分子量标准：v为了判断DNA片段的大小，需要同时加入DNA分子量标准进行电泳。vDNA分子量标准应能覆盖所测DNA片段的预期大小。2022-6-7PCRP

17、CR产物电泳检测操作步骤：产物电泳检测操作步骤：v 1 1）制胶。将适量的琼脂糖加入）制胶。将适量的琼脂糖加入1 1TAETAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2.0%2.0%（w/vw/v）的琼脂糖溶液，然后按每）的琼脂糖溶液，然后按每100 ml100 ml琼脂糖溶液中加入琼脂糖溶液中加入5 l EB5 l EB溶液的比例加溶液的比例加入入EBEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上（防漏胶），插上梳板，室温溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上（防漏胶），插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入下凝固成凝胶后，放入1 1TAETAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔

18、去梳板（如样品孔内有缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板（如样品孔内有气泡，应除去！）。气泡，应除去！）。v 2 2）点样。吸取）点样。吸取10 l10 l的的PCRPCR产物加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入产物加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入DNADNA分子分子量标准；在点试样的同时，应同时点阴性对照、阳性对照和空白对照。量标准；在点试样的同时，应同时点阴性对照、阳性对照和空白对照。v 3 3）电泳。接通电源，在）电泳。接通电源，在5V/cm5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）条件下电泳（长度以两个电极之间的距离计算）条件下电泳30-40 min30-40 min。切记。切记DNAD

19、NA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）！样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）！2022-6-7三种电泳检测的区别三种电泳检测的区别检测对象检测对象电泳方法电泳方法电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽染色方法染色方法室内纯度室内纯度蛋白蛋白非变性聚丙烯非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳（胶厚度（胶厚度0.50.5厘米左右）厘米左右）基础电泳仪基础电泳仪（100V100V左右）左右）垂直小板电垂直小板电泳槽泳槽考马斯亮蓝考马斯亮蓝染色法染色法真实性真实性DNADNA变性聚丙烯酰变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳（胶厚度（胶厚度0.040.04厘米左右）厘米左右）高压电泳仪高压电泳仪（2000

20、V2000V左右）左右）垂直测序电垂直测序电泳槽（大板）泳槽（大板）硝酸银染色硝酸银染色法法转基因转基因DNADNA琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳（胶厚度泳（胶厚度0.3-0.50.3-0.5厘米厘米左右）左右）基础电泳仪基础电泳仪（100V100V左右）左右）水平电泳槽水平电泳槽核酸染色剂核酸染色剂（EBEB等）显等）显色色2022-6-7 真实性检测使用垂直测序电泳槽胶板大小 35cm45cm 厚度0.4mm 转基因检测使用水平核酸电泳槽 胶板大小2016cm，1516cm 厚度3-5mm 纯度检测使用垂直电泳槽胶板大小10.518.5cm 厚度 3-5mm2022-6-72 2、结、结 果果

21、 分分 析析原 则：v如果阳性对照的PCR反应中，玉米内标准ZSSB基因、CaMV 35S启动子和/或NOS终止子和Bt基因得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出SPS基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。v否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。2022-6-7结果判断：v 在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：v 1、在试样PCR反应中，内标准ZSSB基因和Bt基因均得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，无论CaMV 35S启动子和/或NOS终止子是否得到扩增，表明样品检出Bt

22、基因。v 2、在试样PCR反应中，内标准ZSSB基因、CaMV 35S启动子和/或NOS终止子得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，但Bt基因没有得到扩增，或扩增出的DNA片段与预期大小不一致，表明样品检出CaMV 35S启动子和/或NOS终止子，未检出Bt基因。v3、在试样的PCR反应中，内标准ZSSB基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子没有得到扩增，表明样品未检出Bt基因。2022-6-73 3、检测结果异常情况分析、检测结果异常情况分析拖尾（拖尾（ SmearSmear现象）：现象）：原因：原因：n模板不纯模板不纯nB

23、ufferBuffer不合适不合适n退火温度偏低退火温度偏低n酶量过多酶量过多ndNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高n循环次数过多循环次数过多对策：纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数2022-6-7非特非特异异性扩增：性扩增：原因：原因：v模板或引物浓度过模板或引物浓度过高高v酶量过多酶量过多vMgMg2+2+浓度偏高浓度偏高v退火温度偏低退火温度偏低v循环次数过多循环次数过多对策：适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数 2022-6-7假阳性：假阳性：可能的原因：可能

24、的原因：v 样品制备过程中来自环境的污染；样品制备过程中来自环境的污染；v DNADNA提取过程中的污染；提取过程中的污染；v PCRPCR体系配制过程中的污染（前次体系配制过程中的污染（前次PCRPCR产物）。产物）。对策：对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，

25、然后低温贮存。 2022-6-7假阴性：原因：v样品粉碎或混合不够充分；vDNA模板质量不好（降解、含有抑制剂）；vDNA模板量不够；vDNA模板浓度过高。对策：重新粉碎样品；进行充分纯化，去除抑制剂（盐、糖、酚等）；稀释DNA模板量过高2022-6-7阳性对照扩增失败阳性对照扩增失败 阳性对照未扩增出目标基因条带。表明阳性对照未扩增出目标基因条带。表明PCRPCR体系扩增失败。体系扩增失败。 样品虽然扩增出条带但由于阳性对照扩增失败，实验需重做。样品虽然扩增出条带但由于阳性对照扩增失败，实验需重做。 M + - S1S1 S2 S2.2022-6-7扩增体系污染扩增体系污染 空白、阴性对照均扩增出目标基因条带。表明空白、阴性对照均扩增出目标基因条带。表明PCRPCR体系被污体系被污染。需分析污染原因消除污染后重新实验染。需分析污染原因消除污染后重新实验 。M + - B S1 S1 S2 S2 S3 S32022-6-7M S S S B BM:Marker, “”阴性对照，阴性对照， “”阳性对照，阳性对照， “B”空白对照空白对照实验成功实验成功CaMV 35S启动子的扩增（195 bp）谢谢！