血脂测定及方法学评价课件.ppt

1、血脂测定及方法学评价血脂测定及方法学评价基本内容基本内容1.基本概念基本概念2.血脂测定的常规要求血脂测定的常规要求3.血浆脂质测定血浆脂质测定4.血浆脂蛋白测定血浆脂蛋白测定5.载脂蛋白测定载脂蛋白测定6.血浆脂蛋白代谢相关蛋白质与酶的测定血浆脂蛋白代谢相关蛋白质与酶的测定7.基因突变分析基因突变分析基本概念基本概念 血脂血脂 血浆脂蛋白血浆脂蛋白 载脂蛋白载脂蛋白 脂蛋白受体脂蛋白受体 HDL-C、LDL-C、VLDL-C血脂血脂1.定义：定义：指血清指血清/浆中所有脂类物质。浆中所有脂类物质。2.种类：种类：总胆固醇总胆固醇（游离胆固醇（游离胆固醇FC胆固醇酯胆固醇酯CE）甘油三酯甘油三

2、酯磷脂磷脂糖脂糖脂游离脂肪酸游离脂肪酸类固醇类固醇固醇固醇血浆脂蛋白血浆脂蛋白（lipoprotein,LP） 定义定义 共同特征共同特征 分类分类血浆脂蛋白（血浆脂蛋白（lipoprotein,LP） 定义：定义： 脂类不溶或微溶于水，无论是内源性脂类不溶或微溶于水，无论是内源性或外源性脂类均以溶解度较大的脂蛋白复或外源性脂类均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式在血液循环中运输。合体形式在血液循环中运输。LP 共同特征：共同特征： 核心核心：不溶于水的不溶于水的TG和和CE 外壳外壳：少量蛋白质和极性的：少量蛋白质和极性的PL、FFA 桥梁桥梁：PL的极性部分与的极性部分与Prot结合，非极性部

3、分结合，非极性部分 与其他脂类结合与其他脂类结合LP 分类：分类： 超速离心法：超速离心法： CMVLDLLDLHDLAlb-FFA complex 琼脂糖电泳法：琼脂糖电泳法： CM前前 即：即： CMVLDLIDLLDLLP(a) HDL CM前前 前前 载脂蛋白载脂蛋白(apolipoprotein, apoprotein,Apo) 定义：脂蛋白中的蛋白质部分，具有结合定义：脂蛋白中的蛋白质部分，具有结合及转运脂质、稳定及转运脂质、稳定LP，作为脂蛋白受体的，作为脂蛋白受体的配体，参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体配体，参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合及其代谢过程，激活某些与血浆脂的结合

4、及其代谢过程，激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类等作用。蛋白代谢有关的酶类等作用。 分类：分类： Apo A、B、C、D、E、H、J、（、（a） Apo A（A、 A 、A） Apo B（ B 100、 B48） Apo C（C、 C 、CC 02）脂蛋白受体脂蛋白受体 定义：定义：一类位于细胞膜上的糖蛋白。以高一类位于细胞膜上的糖蛋白。以高度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，从而介导细胞对从而介导细胞对LP的摄取与代谢，进一步的摄取与代谢，进一步调节细胞外调节细胞外LP的水平。的水平。 类型：类型： LDL受体受体 VLDL受体受体 清道夫受体清道夫受体H

5、DL-C、LDL-C、VLDL-C 在在LP中有中有prot、ch、PL等，其中等，其中ch含量较含量较为稳定，目前以测定为稳定，目前以测定LP中中ch含量的方法作含量的方法作为为LP的定量依据。的定量依据。血脂测定的常规要求血脂测定的常规要求 在显著改变饮食习惯后应等待在显著改变饮食习惯后应等待36个月测血脂，同时要个月测血脂，同时要求体重恒定。求体重恒定。 采血前采血前12h不要饮酒、咖啡、奶不要饮酒、咖啡、奶 病人禁食病人禁食12h以上，采取静脉血（止血带使用不多于以上，采取静脉血（止血带使用不多于1min），采血时病人取坐位或半卧位（抽血前至少静），采血时病人取坐位或半卧位（抽血前至少

6、静坐坐5min，站立使血脂，站立使血脂） 血脂与年龄、性别、种族等生物因素有关血脂与年龄、性别、种族等生物因素有关 血脂与饮食习惯、吸烟、运动及应激等生活方式有关血脂与饮食习惯、吸烟、运动及应激等生活方式有关 血脂与临床（疾病、药物）有关血脂与临床（疾病、药物）有关 血脂与血标本采集与处理有关血脂与血标本采集与处理有关 一般多用血清标本，用血浆时选用一般多用血清标本，用血浆时选用EDTA-Na2EDTA-Na2抗凝，不用抗凝，不用肝素肝素 四个基本指标（四个基本指标（TCTC、TGTG、HDL-CHDL-C、LDL-CLDL-C）在）在44保存保存3 3天，天，-20 -20 稳定数周，稳定数

7、周，-70 -70 以下长期保存以下长期保存 一次检查结果可疑应几周后复查再作诊断一次检查结果可疑应几周后复查再作诊断血浆脂质测定血浆脂质测定 1.总脂质测定总脂质测定 2.总胆固醇（总胆固醇（TC）测定）测定 3.甘油三酯（甘油三酯（TG）测定）测定 4.磷脂测定磷脂测定 5.游离脂肪酸测定游离脂肪酸测定总脂质测定总脂质测定 方法：方法： 1. 脂质抽提法脂质抽提法 2. 直接测定法直接测定法总胆固醇（总胆固醇（TC）测定）测定 CE占占70%，FC占占30% 分布：分布：LDL中最多中最多 其次是其次是HDL和和VLDL CM最少最少 意义：意义： TC高低通常反映高低通常反映LDL-C的

8、高低，但在一定程的高低，但在一定程度上也受度上也受HDL-C和和VLDL-C水平的影响。水平的影响。总胆固醇（总胆固醇（TC）测定方法）测定方法 同位素稀释同位素稀释-质谱分析法（质谱分析法（ID-MS）：决定性方）：决定性方法法 化学法：其中化学法：其中ALBK法为参考方法法为参考方法 酶法：其中胆固醇氧化酶法为常规方法酶法：其中胆固醇氧化酶法为常规方法TC测定的测定的化学试剂显色法化学试剂显色法（强酸试剂显色法）（强酸试剂显色法） 步骤：步骤： 1.抽提抽提（正己烷、乙醇、石油醚等）（正己烷、乙醇、石油醚等） 2.皂化皂化（KOH） 3.洋地黄皂苷沉淀纯化洋地黄皂苷沉淀纯化 4.显色比色显

9、色比色 Zak反应：反应： ch+浓浓h2so4+Fe3+冰醋酸冰醋酸紫色紫色 （563nm） L-B反应：反应： ch+浓浓h2so4+醋酸酐醋酸酐+冰醋酸冰醋酸绿色绿色（410nm） 四步法四步法 三步法（三步法（正己烷抽正己烷抽提提L-B反应显色为反应显色为公认的公认的参考方法参考方法） 二步法二步法 一步法：其中一步法：其中LB反应直接法反应直接法 为常规为常规方法方法TC测定的测定的胆固醇氧化酶法胆固醇氧化酶法 原理：原理： CE 胆固醇酯酶（胆固醇酯酶（CHE） FCFFA chO2 胆固醇氧化酶（胆固醇氧化酶（COD） 胆烷胆烷-4-烯烯-3-酮酮H2O2 氧电极氧电极 240n

10、m比色比色 Trinder反应反应 （即（即CHOD-PAP法，最常用）法，最常用）评价：快速、准确、标本用量少，便于自动化评价：快速、准确、标本用量少，便于自动化。 TG测定测定 分布：分布： 主要存在于主要存在于CM及及VLDL中，但空腹血中出现中，但空腹血中出现CM是少见的，故空腹血中是少见的，故空腹血中TG代表代表VLDL 。 方法：方法： 化学法：化学法：操作烦琐，影响因素多，准确性差，现较少采用。操作烦琐，影响因素多，准确性差，现较少采用。 酶法：酶法：操作简便，快速准确，可在自动化仪器上批量测定。操作简便，快速准确，可在自动化仪器上批量测定。化学法测定化学法测定TG 基本步骤：基

11、本步骤： 抽提抽提：提取提取TG，去除，去除PL、游离甘油、游离甘油、Glu等干扰等干扰 常选用正壬烷常选用正壬烷/正庚烷正庚烷-异丙醇异丙醇-稀硫酸抽提剂稀硫酸抽提剂 皂化皂化： KOH 水解水解 甘油甘油TG甘油甘油甲醛甲酸甲醛甲酸HIO4氧化氧化：显色显色：A.变色酸显色法变色酸显色法：氯仿提取变色酸显色法为常规方法：氯仿提取变色酸显色法为常规方法B.乙酰丙酮显色法乙酰丙酮显色法：较简便，常用方法：较简便，常用方法C.盐酸苯肼盐酸苯肼-高铁氰化钾法高铁氰化钾法D.三氮唑法三氮唑法乙酰丙酮显色法乙酰丙酮显色法Hantgsch反应反应：甲醛乙酰丙酮甲醛乙酰丙酮NH4+3,5-二乙酰二乙酰-1

12、,4-二氢二甲基吡啶二氢二甲基吡啶（带黄色的荧光物质，（带黄色的荧光物质，412nm)412nm)CDC认为变色酸法与乙酰丙酮荧光法可以为认为变色酸法与乙酰丙酮荧光法可以为参考方法参考方法酶法测酶法测TG小结：小结：TGLPL甘油甘油甘油激酶法：甘油激酶法： （GK)甘油甘油ATPGK3-磷酸甘油磷酸甘油 ADP磷酸甘油脱氢磷酸甘油脱氢酶法酶法磷酸甘油磷酸甘油氧化酶法氧化酶法丙酮酸激酶丙酮酸激酶-LDH法法甘油脱氢酶法甘油脱氢酶法甘油氧化酶法甘油氧化酶法磷酸甘油氧化酶法测磷酸甘油氧化酶法测TG 原理：原理：TG + H2O脂蛋白酯酶（脂蛋白酯酶（LPL）甘油甘油FFA甘油甘油ATP甘油激酶（甘

13、油激酶（GK）Mg2+甘油甘油-3-P ADP 甘油甘油-3-P O2磷酸甘油氧化酶（磷酸甘油氧化酶（GPO）磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮+H2O2H2O24-AAP+4-氯酚氯酚POD醌亚胺醌亚胺H2OHCL评价：准确、灵敏，试剂稳定，线性范围较宽。但要设空白评价：准确、灵敏，试剂稳定，线性范围较宽。但要设空白 去除去除FG的干扰。的干扰。 其中其中两步法为中华医学会检验分会的推荐方法两步法为中华医学会检验分会的推荐方法。甘油氧化酶法测甘油氧化酶法测TG第一步反应：去除游离甘油（第一步反应：去除游离甘油（FG）FG+O2甘油氧化酶甘油氧化酶(GlyOD)甘油醛甘油醛+H2O2H2O2+EMAEP

14、OD无色物质无色物质第二步反应：测定第二步反应：测定TG。在第一步反应。在第一步反应35min后进行后进行TG+3H2OLPL甘油甘油+FFA甘油甘油+O2甘油氧化酶甘油氧化酶(GlyOD)甘油醛甘油醛+H2O2H2O2+4-AAP+EMAEPOD有色物质有色物质磷脂测定磷脂测定 化学法化学法 酶法酶法FFA测定测定 酶法酶法 滴定法滴定法 比色法比色法 AAS HPLC血浆脂蛋白测定血浆脂蛋白测定 通常认为通常认为HDL是动脉粥样硬化的防御因是动脉粥样硬化的防御因素素 通常认为通常认为LDL是动脉粥样硬化的致病因是动脉粥样硬化的致病因素素 这两类这两类LP的测定是测其所含的胆固醇的测定是测其

15、所含的胆固醇（ HDL-C与与 LDL-C） LP(a)的水平高是心脑血管病的独立危险的水平高是心脑血管病的独立危险因素因素血浆脂蛋白测定血浆脂蛋白测定 1.超速离心分离纯化法：多为超速离心分离纯化法：多为CDC的参考方法的参考方法 2.电泳分离法：主要用于定性电泳分离法：主要用于定性 3.血浆静置实验：详见临床生化理论课血浆静置实验：详见临床生化理论课 4.血浆脂蛋白胆固醇测定：血浆脂蛋白胆固醇测定： 1) HDL-C 2) LDL-C 3) LP(a)沉淀分离沉淀分离LP 原理：原理： 由于由于LP的组成与理化性质不同，在不同的的组成与理化性质不同，在不同的聚阴离子聚阴离子（PEG、肝素、

16、磷钨酸等）和不、肝素、磷钨酸等）和不同同2价金属离子价金属离子以及不同以及不同PH值条件下，使值条件下，使LP与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离测定的目的。到分离测定的目的。 举例：举例： 肝素肝素-Mn2+沉淀沉淀LDL与与VLDL 磷钨酸钠磷钨酸钠-Mg2+沉淀沉淀LDL与与VLDL 聚乙烯硫酸盐沉淀聚乙烯硫酸盐沉淀LDLHDL-C测定测定 化学沉淀法：磷钨酸化学沉淀法：磷钨酸- Mg2+沉淀法为常规方法沉淀法为常规方法 均相测定法均相测定法 免疫法免疫法LDL-C测定测定 计算法：计算法：LDL-C=TC - HDL-C + (TG 1/5) 化学沉淀法：化学沉淀法：聚乙烯硫酸盐沉淀法聚乙烯硫酸盐沉淀法(PVS)为常规为常规方法方法 免疫分离法：准确、精密，但成本高免疫分离法：准确、精密，但成本高 匀相测定法：匀相测定法：表面活性剂消除法目前应用最广表面活性剂消除法目前应用最广LP(a)测定测定 免疫法：免疫法：ITA、INA、ELISA、RIA、RID等等 LP(a)-C测定法：超速离心法、麦胚血凝素测定法：超速离心法、麦胚血凝素法、琼脂糖电泳法等法、琼脂糖电泳法等Apo测定测定 电泳法电泳法 免疫法免疫法 层析法层析法 Apo A、 A 、B 100、 C 、CC、（）均为常规检测项目。（）均为常规检测项目。完