2.3分解纤维素的微生物的分离.课件.ppt

1、问题探讨：问题探讨：1、植物体内的多糖、二糖、单糖你知道有有、植物体内的多糖、二糖、单糖你知道有有哪些？哪些？2、纤维素的基本组成单位是什么？、纤维素的基本组成单位是什么？3、纤维素主要分布在植物细胞的什么结构中？、纤维素主要分布在植物细胞的什么结构中？有什么作用？有什么作用？4、你知道哪种植物纤维素的含量最高？在植、你知道哪种植物纤维素的含量最高？在植物体内纤维素主要分布在哪些器官中？物体内纤维素主要分布在哪些器官中？5、我们人能分解纤维素吗？为什么？平常膳、我们人能分解纤维素吗？为什么？平常膳食中为什么强调多吃富含纤维素的食物？牛羊食中为什么强调多吃富含纤维素的食物？牛羊等等草食性动物草食

2、性动物为什么可以只以草为食物而生存？为什么可以只以草为食物而生存？6、纤维素有什么作用？农业生产中有大量的、纤维素有什么作用？农业生产中有大量的家农作物桔杆，你认为应如何有效利用？家农作物桔杆，你认为应如何有效利用？纤维素：棉花棉花是自然是自然界中纤维素界中纤维素含量最高的含量最高的天然产物；天然产物；地球上植物每年产生的纤维素超过地球上植物每年产生的纤维素超过7070亿吨；主要亿吨；主要分布植物的根、茎、叶中，其中分布植物的根、茎、叶中，其中40%-60%40%-60%能被土能被土壤中某些分解利用。壤中某些分解利用。 纤维素纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是是地球上最古老、最丰富的

3、天然高分子，是取取之不尽用之不竭之不尽用之不竭的，人类最宝贵的的，人类最宝贵的天然可再生资源天然可再生资源主要作用：主要作用：1、纺织造纸、纺织造纸 2、生理作用、生理作用 膳食纤维膳食纤维 人类膳食中的纤维素主要含于蔬菜和粗加工人类膳食中的纤维素主要含于蔬菜和粗加工的谷类的谷类，是一种不被消化吸收的物质，过去认为是是一种不被消化吸收的物质，过去认为是“废废物物”，现在认为它在保障人类健康，延长生命方面有着重，现在认为它在保障人类健康，延长生命方面有着重要作用。纤维素的主要生理作用是吸附大量水分，增加粪要作用。纤维素的主要生理作用是吸附大量水分，增加粪便量，促进肠蠕动，加快粪便的排泄，使致癌物

4、质在肠道便量，促进肠蠕动，加快粪便的排泄，使致癌物质在肠道内的停留时间缩短，对肠道的不良刺激减少，从而可以预内的停留时间缩短，对肠道的不良刺激减少，从而可以预防肠癌发生。另由于纤维素比重小，体积大，在胃肠中占防肠癌发生。另由于纤维素比重小，体积大，在胃肠中占据空间较大，使人有饱食感，有利于减肥据空间较大，使人有饱食感，有利于减肥所以称它为第七种营养素。所以称它为第七种营养素。 在草食性动物等的消化道内，在草食性动物等的消化道内，共生有分解纤维素的微共生有分解纤维素的微生物生物，草食动物则依赖草食动物则依赖其消化道中的共生微生物其消化道中的共生微生物将纤维素将纤维素分解，从而得以吸收利用分解，从

5、而得以吸收利用。而人没有分解纤维素的能力而人没有分解纤维素的能力。纤维素酶纤维素酶 农作物秸秆农作物秸秆 等富含等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低； 科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料转化为种类繁多的生物燃料。如如纤维素生物燃料，纤维素生物燃料，最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源纤维素酶在染整纤维素酶在染整上得到了广泛的应用，特别在棉织物整理上，经上得到了广泛的应用，特别在棉织物整理上，经过纤维素酶整理后，棉织物的

6、手感和外观获得很过纤维素酶整理后，棉织物的手感和外观获得很大的改善，因为织物表面的绒毛被除去，处理后大的改善，因为织物表面的绒毛被除去，处理后织物更光洁，颜色更鲜艳。根据处理的目的不同，织物更光洁，颜色更鲜艳。根据处理的目的不同，可进行生化抛光、柔软滑爽、改善光泽以及石磨可进行生化抛光、柔软滑爽、改善光泽以及石磨水洗等加工。水洗等加工。 一、基础知识一、基础知识 纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加

7、入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；另一支试管不添加纤维素酶；思考思

8、考1实验分析：实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？的小实验是如何构成对照的？滤滤纸纸崩崩溃溃法法注意：在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入注意：在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量等量的缓冲液的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pHpH。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，分解后，红色复

9、合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈可根据是否产生可根据是否产生透明圈透明圈来筛选纤来筛选纤维素分解菌维素分解菌四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈透明圈越大，分解透明圈越大，分解纤维素的能力越大。纤维素的能力越大。练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把

10、纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了

11、纤维素分解菌二、实二、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作操作提示提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落实验设计实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到布到鉴别鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样的什么样的环境取样环境取样?依据是什依据是什么？么？

12、培养的目的培养的目的? ? 分析其选择培分析其选择培养基组成，为什养基组成，为什么没有用琼脂？么没有用琼脂？挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?为什么用鉴为什么用鉴别培养基的特别培养基的特点进行分离点进行分离? ?原原理是什么？此理是什么？此方法叫什么方方法叫什么方法？法？ 生物与环境的互相依存关系，生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。境。将滤纸埋在土壤中将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对能使纤维素分解菌相

13、对集中集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于适宜环境。一般应将滤纸埋于深约深约10cm10cm左右左右的的土壤中。土壤中。 酵母膏：是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、酵母膏：是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色，较澄清。酵母浸膏富含蛋白质、氨基色至浅棕色，较澄清。酵母浸膏富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、酸类、肽类、核苷酸、B B族维生素、

14、微量元素。族维生素、微量元素。主要主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子氨基酸及生长因子。一般的用量为。一般的用量为0.2%0.2%2.0%2.0%。 水解酪素（分为酸水解酪素（分为酸水解酪素和酶水解酪素水解酪素和酶水解酪素）：）：是以天然牛奶蛋白为原料，经盐酸水解、脱色、是以天然牛奶蛋白为原料，经盐酸水解、脱色、脱盐、喷雾干燥而成的产品，脱盐、喷雾干燥而成的产品，氨基酸种类齐全，含氮氨基酸种类齐全，含氮和蛋白量均大于和蛋白量均大于80%80%。氨基酸是合成蛋白质的基础，是。氨基酸是合成蛋白质的基础，是人、动植物、微生物最基

15、本的营养成分之一。人和微人、动植物、微生物最基本的营养成分之一。人和微生物可通过蛋白质间接获取氨基酸，但需要胃酸和酶生物可通过蛋白质间接获取氨基酸，但需要胃酸和酶的水解，当蛋白质被盐酸水解成氨基酸组分时药用级的水解，当蛋白质被盐酸水解成氨基酸组分时药用级可作为能量合剂直接供给人们补充能量，试剂级可用可作为能量合剂直接供给人们补充能量，试剂级可用作微生物的培养基。性状白色或浅黄粉末、易溶于水、作微生物的培养基。性状白色或浅黄粉末、易溶于水、极易潮解、具有酱香味。极易潮解、具有酱香味。 培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（

16、能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酪素水解酪素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水 思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些中的实验流程有哪些异同？异同？ 本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课的流程的区别如下。课题题2 2是将土样制成的菌悬液素梯度稀释后直接涂是将土样制成的菌悬液素

17、梯度稀释后直接涂布在布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离接分离得到菌落。本课题先通过得到菌落。本课题先通过选择培养基培选择培养基培养（液体），使纤维素分解菌得到增殖后，养（液体），使纤维素分解菌得到增殖后，再再将菌液梯度稀释后涂布在将菌液梯度稀释后涂布在鉴别培养基鉴别培养基上进行分上进行分离。其他步骤基本一致。离。其他步骤基本一致。 比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿

18、素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养101102103104105106培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的

19、培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)羧甲基纤维素钠又称羧甲基纤维素羧甲基纤维素钠又称羧甲基纤维素，简称，简称CMC或或CMC-Na。羧甲基纤维素钠的来源为棉花或纸浆等纤维用水。羧甲基纤维素钠的来源为棉花或纸浆等纤维用水媒法或溶媒法制成。为白色或微黄色纤维状或颗粒状粉媒法或溶媒法制成。为白色或微黄色纤维状或颗粒状粉末或粗粉，无臭、无味，溶于水，有吸湿性。在面条、末或粗粉，无臭、无味，溶于水，有吸湿性。在面条、速食面条、速食米粉中添加量速食面条、速食米粉中添加量0.1% 0.5%，可使制品，可使制品膨胀而组织润滑，口感良好，不易变形；在面包、饼干、膨胀而组织润滑，口感良好，不易变形；

20、在面包、饼干、糕点中添加糕点中添加0.1%0.2%，可防止水分蒸发和老化，防，可防止水分蒸发和老化，防止油脂渗出，使产品表面光滑，口感细腻；在肉类制品、止油脂渗出，使产品表面光滑，口感细腻；在肉类制品、禽蛋、水禽蛋、水 果、蔬菜中则以果、蔬菜中则以2%3%的水溶液喷洒在食物的水溶液喷洒在食物表面形成一种极薄的膜，可长期贮存食物，保持风味，表面形成一种极薄的膜，可长期贮存食物，保持风味，防止发酵，食用时用水冲洗即可；防止发酵，食用时用水冲洗即可；CMC无营养价值，无营养价值，会吸水胀润，使人有饱腹感，可以用作减肥食品。会吸水胀润，使人有饱腹感，可以用作减肥食品。纤维素分解菌的鉴定培养基为何要加入

21、土豆汁？纤维素分解菌的鉴定培养基为何要加入土豆汁？1、微生物对于碳源的利用是有一定顺序的，先利、微生物对于碳源的利用是有一定顺序的，先利用好用的（如土豆汁里的淀粉）再利用难用的用好用的（如土豆汁里的淀粉）再利用难用的（如纤维素），即便是纤维素分解菌也是如此（如纤维素），即便是纤维素分解菌也是如此2、之前因为目的是培养，不用担心不能形成菌、之前因为目的是培养，不用担心不能形成菌落的问题，所以用纤维素作为唯一碳源，把纤落的问题，所以用纤维素作为唯一碳源，把纤维素分解菌维素分解菌初步筛选初步筛选出来。后来鉴别的时候因出来。后来鉴别的时候因为进行了涂布，菌体密度大大下降，为了让单为进行了涂布，菌体密度

22、大大下降，为了让单个菌体更好的存活下来，形成菌落，就必须先个菌体更好的存活下来，形成菌落，就必须先让这个单细胞菌体发展到一定数量，于是在鉴让这个单细胞菌体发展到一定数量，于是在鉴别培养基中要别培养基中要加入一定量的土豆汁以提供淀粉加入一定量的土豆汁以提供淀粉这种好利用的碳源这种好利用的碳源，当然此时淀粉分解菌也发，当然此时淀粉分解菌也发展起来了，但是加入的淀粉量毕竟是少数，展起来了，但是加入的淀粉量毕竟是少数， 在淀粉分解菌还未能发展到一个菌落的时候淀在淀粉分解菌还未能发展到一个菌落的时候淀粉就用完了，只剩下纤维素了，此时发展到一粉就用完了，只剩下纤维素了，此时发展到一定数量的纤维素分解菌就能

23、继续利用纤维素发定数量的纤维素分解菌就能继续利用纤维素发展成一个菌落，而淀粉分解菌因为不能继续利展成一个菌落，而淀粉分解菌因为不能继续利用纤维素于是增殖受阻（这也是为什么当我们用纤维素于是增殖受阻（这也是为什么当我们观察到淀粉分解菌形成假阳性反应的时候只是观察到淀粉分解菌形成假阳性反应的时候只是一个淡淡的圈，没有纤维素分解菌形成的圈那一个淡淡的圈，没有纤维素分解菌形成的圈那么明显）。么明显）。所以，本试验中加入土豆汁的原因就是所以，本试验中加入土豆汁的原因就是为了先为了先让单个的纤维素分解菌繁殖到一定数量，以便让单个的纤维素分解菌繁殖到一定数量，以便形成菌落形成菌落比较比较项目项目分解尿素的细

24、菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的中，细菌合成的脲酶脲酶将尿素将尿素分解成了分解成了氨氨，氨会使培养基，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高升高。在培。在培养基中加入养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，如，如果果pHpH升高指示剂会升高指示剂会变红变红刚果红可以与刚果红可以与纤维素纤维素形成形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶纤维素酶催化分解后红色催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基

25、上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的菌为中心的透明圈透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来环带出现来鉴定鉴定尿素分解菌尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来透明圈来筛选筛选纤维素分解菌纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红

26、是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强当然分解纤维素的能就强！ 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长

27、则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为

28、了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 五、课题延伸五、课题延伸分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结