细菌耐药机制研究进展(特选材料)课件.ppt

1、细菌耐药机制研究进展细菌耐药机制研究进展浙江大学医学院附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院俞云松俞云松1优选内容Antibiotic interactions with gram negative organismsAntibiotic interactions with gram negative organismspenicillin binding proteinspenicillin binding proteinsOmpFOmpFOmpCOmpC CephalosporinsCephalosporins slower diffusion due toslower diffusion

2、 due tobulk and ionic chargesbulk and ionic charges ImipenemImipenem Rapid diffusion due to small sizeRapid diffusion due to small sizeand zwitterionic and zwitterionic +/- charge)+/- charge)PBP3PBP3PBP2PBP2PBP1aPBP1aPB1bPB1bBeta Lactamases(hydrolyzing enzymes)CBD/RR2优选内容3优选内容一、外膜孔蛋白减少或丢失一、外膜孔蛋白减少或丢

3、失 细胞内抗生素浓度降低细胞内抗生素浓度降低 膜孔蛋白膜孔蛋白(OprD): 4优选内容细胞外膜上的细胞外膜上的某些特殊蛋白是某些特殊蛋白是一种非特异性的、一种非特异性的、跨越细胞膜的水跨越细胞膜的水溶性物质扩散通溶性物质扩散通道。道。膜膜 孔孔 蛋蛋 白白5优选内容革革 兰兰 阴阴 性性 细细 菌菌 细细 胞胞 膜膜6优选内容某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药内在性耐药”或或“固有性耐药固有性耐药”（intrinsically resistant），）

4、，即这种耐即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。致。如如铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。 “先天不足先天不足”7优选内容一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的降低外膜的渗透性而发展成为耐药

5、菌，即原有的孔蛋白通孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。 亚胺培南是一种非典型的亚胺培南是一种非典型的-内酰胺类抗菌药物，主要是通内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。 “后天获得后天获得”8优选内容产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株9优选内容亚胺培南敏感及耐药的

6、亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌产气肠杆菌PFGE图图C1 C2:亚胺培南敏感亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药亚胺培南耐药10优选内容亚胺培南敏感及耐药亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌的产气肠杆菌SDS图图C1 C2:亚胺培南敏感亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药亚胺培南耐药11优选内容PCR扩增扩增Omp36全长及序列分析全长及序列分析IS903 98%（约（约1000bp)12优选内容插入序列引起插入序列引起OprD2缺失（铜绿）缺失（铜绿）ISPa1328约约2000bpOprD213优选内容细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的

7、抗菌药物，使之到达靶位或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性之前失去活性细菌产生的灭活酶主要有：细菌产生的灭活酶主要有：v -内酰胺酶内酰胺酶v 氨基糖苷类钝化酶氨基糖苷类钝化酶v 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶v MLS钝化酶钝化酶二、二、 产生灭活酶产生灭活酶14优选内容 超广谱超广谱 - -内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLsESBLs） 高产高产AmpCAmpC酶酶 碳青霉烯酶碳青霉烯酶 最主要的耐药因素最主要的耐药因素 对对 - -内酰胺抗生素造成威胁内酰胺抗生素造成威胁 - -内酰胺酶内酰胺酶临床上最重要的临床上最重要的 - -内酰胺酶内酰胺酶15优选内容是是质粒质粒介导

8、的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类内酰胺酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺内酰胺酶。酶。ESBLs在分子生物学分类中属于在分子生物学分类中属于A类酶，在类酶，在Bush分类分类中属于中属于2be类酶。类酶。超广谱超广谱 -内酰胺酶内酰胺酶（extended-spectrum -lactamases，ESBLs）16优选内容ESBLs的分类根据基因同源性不同分为：根据基因同源性不同分为：TEM型型 80SHV型型 46CTX-M

9、型型 37OXA型型 18其它型其它型 20http:/www.lahey.org/studies/webt.htm.CTX-M-1组组CTX-M-2组组CTX-M-8组组CTX-M-9组组17优选内容北北京京浙浙江江新新疆疆郑郑州州基基因因型型ECKPECKPECKPECKP合合计计CTX-M-14237763295372209CTX-M-3161661385257CTX-M-245598229CTX-M-22268CTX-M-933CTX-M-281113CTX-M-1311CTX-M-2711CTX-M-2911SHV-12311510SHV-51214SHV-222CTX-M-14+C

10、TX-M -224134416CTX-M-14+CTX-M -322CTX-M-14+SHV-12134CTX-M-3+SHV-1211CTX-M-9+SHV-1211CTX-M-22+SHV-1211CTX-M-24+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M -22+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M -22+SHV-1211未未检检出出 ESBLs 基基 因因型型7814689144合合计计5543109614226586400中国中国400400株株大肠大肠埃希埃希菌和菌和肺炎肺炎克雷克雷伯菌伯菌的基的基因型因型分布分布18优选内容32家医院家医院 1994-2003年年大

11、肠杆菌及肺炎克雷伯菌产大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率百分率0102030405060701994199519961998199920002001200220032004年份年份百分比百分比大肠杆菌大肠杆菌肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌19优选内容头孢菌素酶头孢菌素酶 大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的生染色体介导的AmpC酶。酶。20优选内容 阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌21优选内容ACT-1,DHA-1,CMY (Peki

12、ng)DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai) DHA-1 (Zhejiang)DHA-1,ACT-1 (GuangZhou)DHA-1 is The Predominant Type in ChinaMap of China22优选内容克隆片段克隆片段PCR产物产物1100bp共共6432bp ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1 DHA-1 ampR qacE1 sul15232 bp23优选内容指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类霉烯类抗生素的一类内酰胺酶内酰胺酶分别属于分别属于Amb

13、ler分子分类中的分子分类中的A类、类、B类、类、D类类酶酶 。 碳青霉烯酶碳青霉烯酶 24优选内容 天然来源碳青霉烯酶天然来源碳青霉烯酶 嗜麦芽寡养单胞菌的嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶酶 获得性碳青霉烯酶（获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）分子分类） B类酶（金属酶）：类酶（金属酶）：IMP、VIM类及类及SPM-1 A类酶：类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等等 D类酶：类酶：OXA-23至至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其来源可分为碳青霉烯酶按其来源可分为25优选内容金属酶金属酶 染色体编码的金属酶：染色体编码的金属酶：BC ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1

14、,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。大多来源于环境寄生菌。 获得性金属酶：获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于位于可转移的基因元件可转移的基因元件上，造成区域性传播。上，造成区域性传播。26优选内容IMP型金属酶型金属酶 IMPIMP型金属酶型金属酶GenBankGenBank上已公布上已公布2121种，比较它们相互之种，比较它们相互之间的序列表明：间的序列表明：IMPIMP型金属酶大致可以分为两组：型金属酶大致可以分为两组： 1 1）IMP-1IMP-1、IMP3-7IMP3-7、IMP9IMP91111、IMP-16IMP-16 2 2）IMP-2IMP-2和

15、和IMP-8IMP-8、1212、1313、1919、20 20 27优选内容中国中国 IMP-4 2001年香港年香港 鲍曼鲍曼 2001年广州年广州 杨格枸橼酸杆菌杨格枸橼酸杆菌 、铜绿、铜绿 IMP-1 2004年年12月月 江苏无锡江苏无锡 铜绿铜绿 IMP-8 2001 台湾台湾 铜绿铜绿28优选内容VIM型金属酶型金属酶 VIMVIM型金属酶型金属酶 与与IMPIMP类金属酶同源性类金属酶同源性 4040，但两类金属酶的，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。 目前目前VIMVIM型金属酶型金属酶GenBankGenBank上

16、已公布上已公布1212种，比较它们相互之间的种，比较它们相互之间的序列可将序列可将VIMVIM金属酶大致分为三组：金属酶大致分为三组： 1 1）VIM-1VIM-1、4 4、5 5、11a11a 2 2）VIM-2VIM-2、3 3、6 6、8 8、9 9、1010、11b11b 3 3）VIM-7VIM-729优选内容VIM型金属酶分布型金属酶分布 VIM-1 1999年年 意大利意大利 铜绿铜绿 氧化木糖产碱杆菌氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单恶臭假单胞胞 20032004希腊希腊 大肠大肠 肺克肺克 法国法国 肺克肺克 VIM-2 2000 法国法国 铜绿铜绿 意大利意大利 希腊希腊 日本日本

17、 韩国韩国 葡萄葡萄牙牙 西班牙西班牙 波兰波兰 克罗地亚克罗地亚 智利智利 阿根廷阿根廷 美国美国 中国中国 VIM-3 2001年年 台湾地区台湾地区 铜绿铜绿 VIM-4 2002年年 希腊希腊 铜绿铜绿 2003 瑞典瑞典 铜绿铜绿 2004 意大意大利利 肺克肺克 阴沟阴沟 2004 波兰波兰 铜绿铜绿30优选内容 VIM-5 2004 土耳其土耳其 肺克肺克 铜绿铜绿 VIM-6 2004 新加坡新加坡 恶臭假单胞恶臭假单胞 VIM-7 2004 美国美国 铜绿铜绿 VIM-8 哥伦比亚哥伦比亚 铜绿铜绿 VIM-9，10 英国英国 VIM-11 阿根廷阿根廷 意大利意大利VIM型

18、金属酶分布型金属酶分布31优选内容假单胞菌假单胞菌北京北京（27）上海上海（32）杭州杭州（27）广州广州（32）成都成都（22）金属酶表金属酶表型阳性菌型阳性菌株数株数35310百分率百分率11.115.611.13.10.0金属酶基金属酶基因型阳性因型阳性菌株数菌株数36410百分率百分率11.118.814.83.10.032优选内容 VIM-2基因整合子结构图A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 结构同In72B： S5， S9， S10， S11， S12（S15、H22除外） intI1 attI1 aacA4 59-b VIM-2 59-be aad

19、B 59-be 3-CS intI1 attI1 aacA4 59-be VIM-2 59-be 3-CSAB33优选内容 H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker50kbAB H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker34优选内容类酶类酶包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2酶。碳青霉烯类抗生素水解酶碳青霉烯类抗生素水解酶35优选

20、内容二株产二株产IMI-1阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌PFGE结果结果36优选内容AntibioticsMIC(mg/l)E cloacaeE C600 E.coli C600E8 E.coli DH5 E.coli pT103Imipenem320.38320.2532Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ceftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone2560.51.50.0474C

21、efoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid2561232432Ampicillin/Sulbactam2568641.5NDE cloacae 8, E C600, E.coli C600E8，E.coli pT103和和E.coli DH5 对抗菌药物的体外抗菌活性对抗菌药物的体外抗菌活性37优选内容阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱 54kb 15kb38优选内容Schematic representation of the clo

22、ned E.coRfragmentIS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp 921bp 882bp 876bp 921bp10629bp(GenBank accession number : AY780889 )39优选内容抗菌药物肺炎克雷伯菌亚胺培南32亚胺培南/克拉维酸16美罗培南32美罗培南/克拉维酸16厄他培南256头孢他啶256头孢他啶/克拉维酸256头孢噻肟256头孢噻肟/克拉维酸256头孢吡肟256头孢曲松256头孢西丁256氨曲南256头孢哌酮/舒巴坦256哌拉西林/三唑巴坦256环丙沙星32阿米卡星256多重耐药肺炎克雷伯菌多重耐药肺炎克雷伯菌40优选内容转

23、化试验 抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒 转化DH5，在含1g/ml的亚胺培南的MH平板上筛选 成功筛选到亚胺培南耐药的转化菌（转化质粒约60kb）染色体带61kb41优选内容PCR PCR筛选内酰胺酶耐药基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM 、 OXA-10和KPC-1 以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC 转化菌和克隆菌只有KPC阳性 PCR产物测序分别为TEM-1、SHV-12和KPC-242优选内容转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆）EcoR, Hind，Nhe等酶切酶切NhepTeasy VectorpTeasy

24、 Vector1.5kb在含亚胺培南在含亚胺培南1 g/ml MH平板筛选平板筛选43优选内容克隆片段测序 对重组质粒的插入片段进行步移测序，获得1554bp核苷酸 DNAssist软件分析，1个开放读码框(ORF) 经GenBank Blast程序分析，该ORF与KPC-2 ( GenBank注册号:AY210886) 的核苷酸序列同源性为100% 44优选内容D类酶类酶 （OXA酶）酶）在在Bush分群中属于分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨

25、曲南水解活性也很弱。孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力的能力 碳青霉烯类抗生素水解酶碳青霉烯类抗生素水解酶45优选内容blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要的碳青霉烯酶，ISAba1Aba1与OXA基因的表达和转移密切相关342342株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中株亚胺培南

26、耐药鲍曼不动杆菌中339339株检测到至少一种株检测到至少一种OXAOXA基因，基因，303303株检测到株检测到OXA-23-likeOXA-23-like和和OXA-51-likeOXA-51-like基因，基因，2222株只检测到株只检测到OXA-23-likeOXA-23-like基因，基因，1717株只检测到株只检测到OXA-51-likeOXA-51-like基因；其中在基因；其中在313313株菌株的株菌株的OXA-23-likeOXA-23-like基因上游基因上游3434bpbp处检测到处检测到ISISAba1Aba1，在在1313株菌株的株菌株的OXA-51-likeOXA

27、-51-like基因上游基因上游7 7bpbp处检测到处检测到ISISAba1Aba1。46优选内容v氨基糖苷类钝化酶分为：氨基糖苷类钝化酶分为： 磷酸转移酶（磷酸转移酶（APH） 乙酰转移酶（乙酰转移酶（AAC） 核苷转移酶（核苷转移酶（ANT）v氨基糖苷类钝化酶作用机制：氨基糖苷类钝化酶作用机制： 三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。氨基糖苷类耐药氨基糖苷类耐药47优选内容v庆大霉素高水平耐药（庆大霉素高水平耐药（HLGR ） 主要的耐药机制主要的耐药机制 氨基糖

28、苷类修饰酶氨基糖苷类修饰酶 耐药基因耐药基因 百分率百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90% APH(2)-Ic aph(2)-Ic APH(2)-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib 10%氨基糖苷类耐药氨基糖苷类耐药48优选内容8,724bpORF1ORF2ORF4 ORF353ISEcp1 (tnpA) aph-Ie repD str部分序列部分序列 49优选内容三、靶位改变三、靶位改变50优选内容主要抗菌药物作用靶位主要抗菌药物作用靶位 -内酰胺类内酰胺类 青霉素结合蛋白（青霉素结合蛋白（PBP） 氨基糖

29、苷类氨基糖苷类 核糖体核糖体30S亚基亚基 大环内酯类大环内酯类 核糖体核糖体50S亚基亚基 氟喹诺酮类氟喹诺酮类 DNA旋转酶（拓扑异构酶旋转酶（拓扑异构酶 ）、拓扑异构酶）、拓扑异构酶 糖肽类糖肽类 D-丙氨酰丙氨酰D-丙氨酸丙氨酸 四环素类四环素类 核糖体核糖体50S亚基亚基 51优选内容PBP2a的作用PBP2a与与-内酰胺抗生素亲和力低，替代正常内酰胺抗生素亲和力低，替代正常PBP功能功能 87KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP452优选内容53优选内容54优选内容DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR

30、1mecAorfXJ1J3J2SCCmec55优选内容56优选内容IV型57优选内容VSHA-MRSACA-MRSA 高高 耐药性耐药性 较低较低 阴性阴性 PVL 阳性阳性I、II、III SCCmec IV、V58优选内容金葡菌耐药性的发展历程金葡菌耐药性的发展历程S. aureusPenicillin-resistantS. aureusMethicillin-resistantS. aureus (MRSA)PenicillinMethicillinVancomycin-resistantenterococcus (VRE)Vancomycin (glycopeptide)-Inter

31、mediate-ResistantS. Aureus （VISA、GISA）Vancomycin-ResistantS. Aureus（VRSA）Vancomycin19401960s1990s1996Superbugs200259优选内容氟喹喏酮的耐药机理60优选内容v糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁等，是糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁等，是高分子量的疏水性化合物。高分子量的疏水性化合物。v主要耐药机制：主要耐药机制： VRE VRE的细胞壁肽糖前体末端的的细胞壁肽糖前体末端的D-D-丙氨酰丙氨酰- -D-D-丙氨丙氨酸酸发生了改变，万古霉素不能与之相结合，因发生了改变，万古霉素不能与

32、之相结合，因此不能抑制此不能抑制VREVRE的细胞壁合成。的细胞壁合成。 耐万古霉素的肠球菌（耐万古霉素的肠球菌（VRE）61优选内容transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp (ZY02, HS3 )表示表示PCR扩增扩增vanYvanZ10Kb （ZY01）含含VanAVanA基因簇的转座子基因簇的转座子转座入各种质粒，或通转座入各种质粒，或通过接合转座导致过接合转座导致VREVRE耐耐药性的传播药性的传播 62优选内容大环内酯类的耐药机制大环内酯类的耐药机制 核糖体靶位点的改变核糖体靶位点的改变: erm 编码，高耐编码，高耐; 法法国、

33、西班牙、中国国、西班牙、中国 主动外排泵主动外排泵: mef 编码，低耐编码，低耐 ，加拿大、，加拿大、美国、美国、 修饰酶修饰酶63优选内容16S rRNA16S rRNA甲基化酶甲基化酶 氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌16S rRNA 以往认为最重要的氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药物，引起一种或几种药物耐药 2002最新发现一类新的氨基糖苷类抗生素耐药机制： 16S rRNA甲基化酶，引起药物作用位点的甲基化，导致细菌对所有氨基糖苷类抗生素高水平耐药，目前发现4种：armA、rmtA、rmtB、rmtC 多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率

34、和耐药水平高 16S rRNA甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究64优选内容700株鲍曼不动杆菌对5种氨基糖苷类抗生素体外抗菌活性5 5种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于6060；377377株（株（53.953.9）菌株对）菌株对5 5种氨基糖苷种氨基糖苷类抗生素均耐药；类抗生素均耐药；334334株株（47.747.7）菌株）菌株armAarmA阳性；阳性；armAarmA阳性菌株对上述所有氨基糖苷类阳性菌株对上述所有氨基糖苷类抗生素均高水平耐药抗生素均高水平耐药, ,MICMIC256mg/L256mg/L 反复进行接合实验、质粒

35、抽提、电转化均反复进行接合实验、质粒抽提、电转化均未成功未成功 Southern-blot Southern-blot杂交证实杂交证实armAarmA基因位于克基因位于克隆隆A A、B B、C C约约220kb220kb、300kb300kb、220kb220kb大小的染大小的染色体色体ApaIApaI酶切条带上酶切条带上65优选内容四、主动外运四、主动外运 有些抗菌药物（常见的如四环素类及喹诺酮类）有些抗菌药物（常见的如四环素类及喹诺酮类）能诱导细菌的主动外运，抗菌药物难以在细菌内积累能诱导细菌的主动外运，抗菌药物难以在细菌内积累到有效浓度，造成对抗菌药物耐药程度的普遍提高。到有效浓度，造成

36、对抗菌药物耐药程度的普遍提高。66优选内容外排泵的结构外排泵的结构外排系统由外排系统由3个部分组成：个部分组成：位于内膜的肿瘤耐药分化家族位于内膜的肿瘤耐药分化家族(resistantnodulationdivision family，RND)的的质膜转运体质膜转运体内外膜之间的内外膜之间的膜周连接蛋白或膜融合蛋白膜周连接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜的位于外膜的孔道形成蛋白孔道形成蛋白(0EP) 67优选内容组间外排泵表达量均值比较组间外排泵表达量均值比较0246810121416IMPS MEMS IMPR MEMSIMPR MEMIIMPR MEMRoprDmexXmexAoprMo

37、prN68优选内容 是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。其生物将自身包裹其中而形成的膜状物。其生化组成为化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物藻酸盐多糖和蛋白复合物。菌膜。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药物作用于菌体可阻止巨噬细胞、抗体、药物作用于菌体五、细菌生物被膜（五、细菌生物被膜（Biofilm）69优选内容生生 物物 被被 膜膜70优选内容 细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生高细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生高度耐药性，原因有度耐药性，原因有细菌生物被膜

38、可减少抗菌药物渗透细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用杀菌作用71优选内容其他耐药机制其他耐药机制 缺乏自溶酶缺乏自溶酶 替代途径替代途径 酶的过量产生等酶的过量产生等 靶位保护机制靶位保护机制72优选内容质粒介导的喹喏酮耐药质粒介导的喹喏酮耐药 1998199

39、8年年George.A.JacobyGeorge.A.Jacoby等等从一株从一株肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌（UAB1UAB1）中中发现能介导发现能介导多种抗生素耐药的质粒多种抗生素耐药的质粒pMG252pMG252，经接经接合传递后其接合子对环丙沙星的耐药合传递后其接合子对环丙沙星的耐药性增加近性增加近3030倍倍( (MIC 0.0080.25g MIC 0.0080.25g /mL)/mL)。 在该质粒内发现了喹诺酮耐药（在该质粒内发现了喹诺酮耐药（q quiuin nolone olone r resistanceesistance）基因，命名基因，命名为为qnrqnr (Lancet1

40、998; 351: 79799) 2. 接合接合(conjugation)接合：接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。73优选内容作用机制作用机制QnrQnr通过与通过与旋转酶旋转酶特异地结合从而影响酶的特异地结合从而影响酶的内在活性内在活性, ,降低了酶与降低了酶与DNADNA的结合的结合, ,导致喹诺导致喹诺酮类药物的作用靶位数量减少酮类药物的作用靶位数量减少QnrQnr与与旋转酶旋转酶的结合的结合, ,改变了药物结合区域的改变了药物结合区域的构象构象,

41、 ,从而降低了药物识别靶位的效率从而降低了药物识别靶位的效率保护拓扑异构酶保护拓扑异构酶细菌对拓扑异构酶细菌对拓扑异构酶的保护作用与的保护作用与DNADNA旋转旋转酶类似酶类似Hegde, S.S. et al. Science 308:1480, 2005QnrDNA旋旋转酶转酶74优选内容表表 5株株qnrA阳性大肠埃希菌及其接合菌的阳性大肠埃希菌及其接合菌的MIC值值菌株菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP63128256643225616212256Tc631410.52564414256140642566432322888256Tc140142116288425

42、6142484162564424256Tc1420.50.511322882256Z8161616321284256256256256TcZ80.060.060.1250.06128464256256256Z11326416321284256256256256TcZ110.060.060.1250.0664464256256256J53 0.015 0.125 0.125 0.03 0.06 0.1254 1 1 2 J53为受体菌为受体菌75优选内容表表3 8株株qnrA阳性肺炎克雷伯菌及其接合菌的阳性肺炎克雷伯菌及其接合菌的MIC值值菌株菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAK

43、AMP14-26412864128322111256Tc14-20.250.510.251622212562564256643225616422256Tc2518121284414256316425612812825616212256Tc31181225684122569628221282428256Tc961812256841425615181684644428256Tc1511110.25321212256152864441282428256Tc1520.520.50.56414142561533212816163264256256256256Tc1530.5112161212256156

44、4821644428256Tc1562820.25644414256J530.0150.1250.1250.030.060.125411276优选内容质粒质粒DNA与与PCR 产物探针的产物探针的Southern杂交杂交A: 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌96号原始菌号原始菌 C: 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌25号原始菌号原始菌B: 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌96号接合菌号接合菌 D: 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌25号接合菌号接合菌50kb图7：部分菌株质粒电泳图图8：质粒DNA与qnrA探针的Southern杂交图图9：质粒DNA与CTX-M-24探针的Southern杂交图V517 D C B A A

45、 B C D V517 V517 D C B A50kb53.7kb7.2kb5.6kb3.9kb3.0kb2.7kb5.1kb2.1kb50kb77优选内容质粒全序列测定质粒全序列测定 用鸟枪法对同时含有用鸟枪法对同时含有qnrA和和CTX-M 两个基因的接合菌质粒进行两个基因的接合菌质粒进行全序列测序全序列测序 构建文库：超声打碎接合菌质粒全长构建文库：超声打碎接合菌质粒全长DNA，参数参数200w，8s，回收回收1.5kbp3.0kbp片段片段，连接入载体片段片段，连接入载体PUC18 测序采用测序采用Sanger双脱氧末端终止法，用双脱氧末端终止法，用ABI3730型自动测序仪进型自动

46、测序仪进行双向测序行双向测序 用用Phred软件读取测序数据，去除低质量碱基，用软件读取测序数据，去除低质量碱基，用Cross-match软软件去除载体序列，件去除载体序列，Phrap软件进行序列拼接，软件进行序列拼接，Consed软件观察和软件观察和修正拼接结果修正拼接结果 78优选内容 int1 blaOXA-30 catB3 aar3 sull orf513 qnrA ampR sull orf5 orf6 IS6100 EcoRII图10：96号菌株（上图）与In37（下图）中qnrA的周围基因环境比较int1 sull orf513 qnrA ampR sull orf5 orf6

47、IS6100 EcoRII9696号菌株接合菌质粒部分测序结果号菌株接合菌质粒部分测序结果1 1 aac(6)IbqacE 1aac(6)IbqacE 1qacE 15-CSGene cassettes3-CSCommon regionUniqueregion3-CS qacE 1 96号菌株号菌株In3779优选内容图图11：96号菌株号菌株CTX-M-24的周围基因环境的周围基因环境 1242 bp 1656bp 876bp 1057bp 1118bpTn1721 ISEcp1B CTX-M-24 IS903D iron 96号菌株接合菌质粒部分测序结果号菌株接合菌质粒部分测序结果280优

48、选内容pKP9667850bpTraN TraDTraCTraBKorATraLKikAtransposase of Tn10transposase of Tn1721Tn1721 resolvaseRestriction EndonucleaseIS903D transposaseCTX-M-24transposasefosfomycin-resistance proteintransposase of Tn10TraOIS6100 transposaseOrf5Sul1AmpRQnrA1Orf513Sul1AAC(6)-IbintegraseresolvaseRepAArdKMprMucBMucAArdBArdRCcgEIIICcgDArdACcgAIOrfDStbCStbBStbATraKTraJTraIrelaxasetetracycline resistance repressor TetAfipAendonucleaseTraGTraF菌株菌株ZJ96的质粒图谱的质粒图谱81优选内容 82优选内容