沙蚕体内微生物在农抗、农药降解方向的利用研究课件.ppt

1、1 v1.1.我国有机磷农药的使用情况我国有机磷农药的使用情况v2.2.沙蚕利用研究进展沙蚕利用研究进展v3.3.研究的目的与意义研究的目的与意义21. 机磷农药污染机磷农药污染3复杂性复杂性 污染源多样，污染物也具有多样性，污染源多样，污染物也具有多样性， 复合污染特点日益突出。复合污染特点日益突出。普遍性普遍性 污染面积增加明显，开始呈连续分布污染面积增加明显，开始呈连续分布,农田、河流农田、河流 污染严重污染严重异质性异质性 由多种复杂成分组成的污染物在非流体介质中存在由多种复杂成分组成的污染物在非流体介质中存在 浓度梯度。浓度梯度。累积性累积性 污染物含量呈增加趋势污染物含量呈增加趋势

2、 持久性持久性 不易被生物利用，污染物存在的持久性不易被生物利用，污染物存在的持久性有机磷农药的降解途径有机磷农药的降解途径4光催化降解光催化降解氧化降解氧化降解 光反应产光反应产物速率受多物速率受多种因素影响，种因素影响，不易控制不易控制 微生物降解微生物降解研究重点和热点研究重点和热点 有机磷农药的降解途径有机磷农药的降解途径成本过高成本过高2.沙蚕的研究与利用沙蚕的研究与利用5 沙蚕（Nereis），俗名“海蜈蚣、海虫”，是广泛分布在近岸海域的无脊椎动物，属环节动物门，多毛纲，游走目，沙蚕科。 国外研究表明：沙蚕对重金属等污染物非常敏感，常被作为环境监测的指示生物（Dallinger R

3、, 1993）。 沙蚕种类繁多，分布广泛。仅我国近海就有80多种，分布在我国的从南至北的各个近岸海域。同时它又是各种鱼、虾和蟹类的饵料。因此，它的丰富度会直接关系近岸海域食物链的兴衰和生物多样性。 最近有研究表明某些沙蚕类群对重金属和石油烃胁迫表现出异常的适应性和高度的耐受性（Mouneyrac C, 2003；Zhou QX , 2003；Christensen M, 2002）。6v 双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近 年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质（如：年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质（如：P-胍

4、基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓胍基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓素等）。鉴于其可以生活在污染严重的环境，并能帮助改素等）。鉴于其可以生活在污染严重的环境，并能帮助改善和治理环境污染善和治理环境污染(由于沙蚕能摄食底泥中的沉积物、有由于沙蚕能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑、微生物等有机污染物，常用于海洋污染底质原位机碎屑、微生物等有机污染物，常用于海洋污染底质原位修复修复 。林更明等。林更明等2009)，故推测其体内可能具有多种生物，故推测其体内可能具有多种生物活性物质或特殊的微生态群，以帮助其拮抗外界污染环境活性物质或特殊的微生态群，以帮助其拮抗外界污染环境的损害。

5、的损害。 3研究目的及意义研究目的及意义v目的：针对我国有机磷农药污染问题，从海洋目的：针对我国有机磷农药污染问题，从海洋生物沙蚕体内筛选出具体抗菌及高效降解有机生物沙蚕体内筛选出具体抗菌及高效降解有机磷农药的功能微生物磷农药的功能微生物 。v意义：为减少农药对生态环境和人体健康所带意义：为减少农药对生态环境和人体健康所带来危害，提供微生物资源和技术支撑来危害，提供微生物资源和技术支撑78沙蚕体内细菌沙蚕体内真菌沙蚕体内放线菌9活性菌株的初筛活性菌株的初筛采用杯碟法，将经过初筛活性效果明显的菌株制备发酵液，采用杯碟法，将经过初筛活性效果明显的菌株制备发酵液，离心取上清，吸取离心取上清，吸取20

6、0l注入牛津杯，将注入无菌水的平板注入牛津杯，将注入无菌水的平板作为对照。作为对照。10SCF-18产物抑菌谱的测定产物抑菌谱的测定v 在无菌条件下，用移液管吸取在无菌条件下，用移液管吸取SCF-18发酵滤液发酵滤液2.5ml于于培养皿内，加入融化好的土豆培养基培养皿内，加入融化好的土豆培养基10ml混合均匀。混合均匀。冷却后将各种病原菌菌丝块分别接种于培养皿中央，冷却后将各种病原菌菌丝块分别接种于培养皿中央，28培养。以无菌水代替发酵液作为对照。当对照组菌培养。以无菌水代替发酵液作为对照。当对照组菌丝长至接近皿边缘时，量取菌丝直径（减去菌丝块直丝长至接近皿边缘时，量取菌丝直径（减去菌丝块直径

7、）。径）。v 按下列公式求抑菌率：按下列公式求抑菌率： 抑菌率抑菌率=（对照组菌丝直径（对照组菌丝直径-处理组菌丝直径）处理组菌丝直径）/对照组菌对照组菌丝直径丝直径100%抑菌谱的测定抑菌谱的测定拮抗菌拮抗菌SCF-18抑菌率抑菌率CSF-18发酵液对立枯丝核菌的抑制情况发酵液对立枯丝核菌的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况发酵液对大麦根腐病的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况发酵液对大麦根腐病的抑制情况16SrRNA序列分析（链霉菌属）序列分析（链霉菌属）16SrDNA序列分析序列分析 将大连宝生物（将大连宝生物（Takara）公司测得菌株）公司测得菌株SCF-

8、18的的16SrDNA序列与序列与Genbank中相关数据进行中相关数据进行BLAST相似性分析，相似性分析，根据序列同源性从高到低原则，选取相近的根据序列同源性从高到低原则，选取相近的9个菌株的个菌株的16S rDNA序列，运用序列，运用MEGA4.0软件构建系统发育树。结果表明：与之同源软件构建系统发育树。结果表明：与之同源性较高的均为链霉菌（性较高的均为链霉菌（Streptomyces），其中），其中SCF-18与淡紫灰与淡紫灰链霉菌（链霉菌（S. lavendula）同源性为）同源性为100%。菌落形态、培养等特征。菌落形态、培养等特征与淡紫灰链霉菌（与淡紫灰链霉菌（S. lavend

9、ula）也相符合。因此，将菌株）也相符合。因此，将菌株SCF-18鉴定为淡紫灰链霉菌（鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendula），命名为），命名为Streptomyces lavendula strain SCF-18。基于基于16SrRNA序列同源性的系统发育树序列同源性的系统发育树生理生化反应生理生化反应v 温度对菌株生长的影响温度对菌株生长的影响 取取3mL菌液至菌液至100mL改良高氏一号培养基中，在温度为改良高氏一号培养基中，在温度为20 、25、30 、35、38 、40 条件下，震荡培养，分别用未条件下，震荡培养，分别用未接种菌液培养基为对照，每个处理设置

10、接种菌液培养基为对照，每个处理设置3个平行，个平行，4d后取菌液于紫后取菌液于紫外分光光度仪外分光光度仪600nm波长测定光吸收值。波长测定光吸收值。v pH值对菌株生长的影响值对菌株生长的影响 取取3ml菌液转入装有菌液转入装有100ml液体高氏培养基三角瓶中，将其放入恒液体高氏培养基三角瓶中，将其放入恒温摇床，在温摇床，在pH 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9条件下震荡培条件下震荡培养，以未接种菌液培养基为对照，每个处理设置养，以未接种菌液培养基为对照，每个处理设置3个平行。个平行。4天后天后取菌液测定光吸收（取菌液测定光吸收（OD600）。）。生理生化反应生理生化反应生

11、理生化反应生理生化反应v 盐度对菌株生长的影响盐度对菌株生长的影响 在高氏培养基中加入在高氏培养基中加入NaCl，使其质量分数分别为，使其质量分数分别为2%、3%、5%、7%和和9%，3次重复，划线接种次重复，划线接种SCF-18，培，培养养4d后观察记录其生长情况。后观察记录其生长情况。结论结论v 本研究通过对双齿围沙蚕（本研究通过对双齿围沙蚕（P. aibuhitensis）内生菌株的分离，筛）内生菌株的分离，筛选出一株可抑制立枯丝核菌生长的放线菌选出一株可抑制立枯丝核菌生长的放线菌SCF-18。采用分子生物。采用分子生物学方法，并结合菌体形态、培养特征等方法将该放线菌鉴定为淡紫学方法，并

12、结合菌体形态、培养特征等方法将该放线菌鉴定为淡紫灰链霉菌（灰链霉菌（S. lavendula）。其对立枯丝核菌（）。其对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Khn）抑制作用较强，）抑制作用较强，50%菌体发酵液基本上可以完全抑菌体发酵液基本上可以完全抑制以上两种病原菌的生长。为进一步发酵利用拮抗菌制以上两种病原菌的生长。为进一步发酵利用拮抗菌SCF-18，本，本研究针对发酵过程中影响最终产物的重要细胞反应参数，如：温度、研究针对发酵过程中影响最终产物的重要细胞反应参数，如：温度、酸碱度、渗透压进行研究。发现放线菌酸碱度、渗透压进行研究。发现放线菌SCF-18生长最适温度为生长最适温度为30，适于在中性偏碱环境下生长，渗透压耐受能力较强。从目前，适于在中性偏碱环境下生长，渗透压耐受能力较强。从目前形势来看形势来看, 生物防治是一种经济有效且环境友好的防治方法，前景生物防治是一种经济有效且环境友好的防治方法，前景十分广阔。本研究所分离的放线菌十分广阔。本研究所分离的放线菌SCF-18对立枯丝核等病原菌表对立枯丝核等病原菌表现出明显的抑制作用，日后将对其抑菌机制进行深入探索，以期为现出明显的抑制作用，日后将对其抑菌机制进行深入探索，以期为此类抑菌剂的研发提供理论指导和参考依据。此类抑菌剂的研发提供理论指导和参考依据。22