组织取材、固定和常规H&E染色课件.ppt

1、取材取材/固定固定/H&EHT lab doc组织标本取材组织标本的取材常受到各种组织标本的取材常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：点，组织取材时应注意： 取材用具必须锋利，以免组织受取材用具必须锋利，以免组织受挤压；挤压；取材部位必须是主要病变区；取材部位必须是主要

2、病变区；必须取病灶与正常组织交界区；必须取病灶与正常组织交界区；必要时取远距病灶区的正常组织必要时取远距病灶区的正常组织作对照。作对照。为充分保存组织的抗原性，标本为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理，不能长时间暴露在离体后应立即处理，不能长时间暴露在空气中，组织切除后空气中，组织切除后, ,如果不能及时固如果不能及时固定或冻存定或冻存, ,可以放入生理盐水或可以放入生理盐水或PBSPBS中短中短时间保存。否则，立即速冻进行冰冻切时间保存。否则，立即速冻进行冰冻切片，或立即用固定液固定后进行脱水、片，或立即用固定液固定后进行脱水、透明、浸蜡、包埋制成石蜡组织块。如透明、浸蜡、包埋制成石

3、蜡组织块。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或- -7070冰箱内备用。冰箱内备用。为了避免组织形成冰晶，组织冻存前为了避免组织形成冰晶，组织冻存前需要蔗糖处理，密封后冻存。需要蔗糖处理，密封后冻存。蔗糖处理液使用浓度为蔗糖处理液使用浓度为5%-30%5%-30%。一般。一般光镜研究，仅用光镜研究，仅用20%20%蔗糖处理已足矣，蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（行蔗糖（5%5%、10%10%、15%15%、20%20%及及20%20%蔗蔗糖糖-5%-5%甘油等）处理，以确保其良好甘油等）处理，以确保其良好的细

4、微结构。的细微结构。标本刚放入蔗糖液时常浮在上面，标本刚放入蔗糖液时常浮在上面，当标本沉底后即可进行冷冻保存。通当标本沉底后即可进行冷冻保存。通常光镜标本浸泡在常光镜标本浸泡在20%20%蔗糖液中过夜。蔗糖液中过夜。都能达到要求。组织冻存的主要目的都能达到要求。组织冻存的主要目的是为研究作准备，组织学研究不一定是为研究作准备，组织学研究不一定都采用石蜡制片，凡是可以将组织制都采用石蜡制片，凡是可以将组织制成蜡块的一般不采用冷冻保存。因为成蜡块的一般不采用冷冻保存。因为保存组织蜡块即方便又可靠，可以长保存组织蜡块即方便又可靠，可以长期室温保存。期室温保存。为了防止挤压组织，一般不用剪为了防止挤压

5、组织，一般不用剪刀取材，可以用手术刀片或剃须刀片，刀取材，可以用手术刀片或剃须刀片，组织切面要平整。组织切面要平整。较大的实质性器官需要切开固定，较大的实质性器官需要切开固定，带包膜的组织要将包膜剖开固定，胃、带包膜的组织要将包膜剖开固定，胃、肠、胆囊等应将内容物用生理盐水或肠、胆囊等应将内容物用生理盐水或PBSPBS洗掉后固定，避免用刀刮除内容洗掉后固定，避免用刀刮除内容物，组织取材后避免水洗。物，组织取材后避免水洗。一般取材后用一般取材后用10%10%福尔马林福尔马林（10% 10% NBF）固定）固定。常规取材厚常规取材厚度度 0.2-0.3 0.2-0.3cmcm，一般不超过，一般不超

6、过0.50.5cmcm。组织块大小组织块大小1.51.5cm1.5 cm1.5 cm0.2 -0.3cmcm0.2 -0.3cm，免疫组化和原免疫组化和原位杂交位杂交1 1cm 1cm 0.2cmcm 1cm 0.2cm为宜。为宜。取材的组织要新鲜，固定要及时。取材的组织要新鲜，固定要及时。固定的作用固定是组织学和细胞学技术研固定是组织学和细胞学技术研究工作的基础。目的是使细胞和组织究工作的基础。目的是使细胞和组织尽可能保存的和生存状态一样。因此，尽可能保存的和生存状态一样。因此，组织块、冰冻切片或细胞涂片通常需组织块、冰冻切片或细胞涂片通常需要放入固定剂中固定。固定剂的作用要放入固定剂中固定

7、。固定剂的作用主要是阻止内源性溶酶体酶的自溶抑主要是阻止内源性溶酶体酶的自溶抑制细菌和霉菌生长。细菌和霉菌生长制细菌和霉菌生长。细菌和霉菌生长会引起组织腐败。会引起组织腐败。总之，固定剂能够保存细胞和总之，固定剂能够保存细胞和组织形态。为组织和细胞的制备打组织形态。为组织和细胞的制备打基础。在细胞和组织研究过程中固基础。在细胞和组织研究过程中固定剂扮演着保护角色。固定剂通过定剂扮演着保护角色。固定剂通过凝固、生成添加化合物或两者结合，凝固、生成添加化合物或两者结合，使蛋白质改变原有的性质。在蛋白使蛋白质改变原有的性质。在蛋白质结构内发生构造改变，引起酶的质结构内发生构造改变，引起酶的失活。失活

8、。 根据研究的目的不同选用不同的固根据研究的目的不同选用不同的固定剂，通过限定固定剂保存组织内定剂，通过限定固定剂保存组织内原有的成分。原有的成分。不同的研究目的选择不同的固定不同的研究目的选择不同的固定剂。总是折衷地改变固定剂和固定方案剂。总是折衷地改变固定剂和固定方案，细胞学固定方案完全不同于组织学和电细胞学固定方案完全不同于组织学和电镜镜。GiemsaGiemsa、罗曼诺夫斯基染色法染色罗曼诺夫斯基染色法染色前需要空气干燥前需要空气干燥，干燥后选择一种高等干燥后选择一种高等级甲醇固定级甲醇固定1-3 1-3 minmin。而巴士染色适合而巴士染色适合于湿固定于湿固定。 空气干燥涂片的优点

9、比湿空气干燥涂片的优点比湿固定好固定好。能把细胞成分完整精确的保存能把细胞成分完整精确的保存于载玻片上于载玻片上。戊二醛常用于电镜标本的固定，戊二醛常用于电镜标本的固定，戊二醛的固定速度很快，但渗透力戊二醛的固定速度很快，但渗透力差。总之，戊二醛对细胞浆和核的差。总之，戊二醛对细胞浆和核的细微结构固定效果较好。标准固定细微结构固定效果较好。标准固定液为液为2%2%戊二醛。选择固定液对于免戊二醛。选择固定液对于免疫细胞化学技术是十分重要，例如，疫细胞化学技术是十分重要，例如，保存抗原选用甲醇固定不理想。尤保存抗原选用甲醇固定不理想。尤其是白细胞表面抗原，通常选用无其是白细胞表面抗原，通常选用无水

10、丙酮固定水丙酮固定1-31-3minmin。甲醛基础固定剂用于细胞浆抗甲醛基础固定剂用于细胞浆抗原和膜结合的免疫球蛋白固定比较稳原和膜结合的免疫球蛋白固定比较稳定。福尔马林定。福尔马林- -丙酮混合应用用于淋丙酮混合应用用于淋巴细胞标记物的固定比较好。细胞涂巴细胞标记物的固定比较好。细胞涂片用片用95%95%乙醇固定或聚乙二醇乙醇固定或聚乙二醇- -乙醇液乙醇液喷雾固定对多数抗原的保存是满意的。喷雾固定对多数抗原的保存是满意的。乙醇不适合用于淋巴瘤标记物固定，乙醇不适合用于淋巴瘤标记物固定，例如，例如，T T和和B B细胞抗原。细胞抗原。一种固定液单独使用往往很一种固定液单独使用往往很难适应多

11、种组织和细胞成分的保存，难适应多种组织和细胞成分的保存，而且容易产生较大的副作用。因此，而且容易产生较大的副作用。因此，在实际工作中，通常将几种固定剂在实际工作中，通常将几种固定剂按一定比例配制成复合固定液使用。按一定比例配制成复合固定液使用。复合固定液的种类很多，目前还没复合固定液的种类很多，目前还没有一种标准的固定剂适用于各种组有一种标准的固定剂适用于各种组织和细胞成分及抗原成分的保存。织和细胞成分及抗原成分的保存。因此在具体使用时，必须对各种固因此在具体使用时，必须对各种固定剂的性能有所了解。定剂的性能有所了解。根据组织大小确定固定时间，根据组织大小确定固定时间，常规常规H.EH.E染色

12、固定梢长一点没有什么染色固定梢长一点没有什么关系。如果做免疫组化固定时间不关系。如果做免疫组化固定时间不宜太长，短时间甲醛固定会造成部宜太长，短时间甲醛固定会造成部分组织抗原活性受到遮蔽。，分组织抗原活性受到遮蔽。，1.01.0X1.0X0.3cmX1.0X0.3cm大小的组织，用大小的组织，用10%10%缓冲福尔马林中固定缓冲福尔马林中固定6-246-24小时不会小时不会有影响。有影响。缓冲福尔马林固定组织的速度大缓冲福尔马林固定组织的速度大约约1-41-4小时小时/ /mmmm。比较大的标本应该延比较大的标本应该延长固定时间。一般固定后及时进行组长固定时间。一般固定后及时进行组织脱水处理，

13、如果不能及进行组织脱织脱水处理，如果不能及进行组织脱水处理。固定完成后可以将组织转移水处理。固定完成后可以将组织转移到到70%70%乙醇中保存，推测这样做的目的乙醇中保存，推测这样做的目的可以解除甲醛对组织继续固定，有利可以解除甲醛对组织继续固定，有利于组织抗原成分的保存。另外，组织于组织抗原成分的保存。另外，组织脱水通常从脱水通常从70%70%乙醇开始乙醇开始,70%,70%乙醇即可乙醇即可以保存组织也不会影响组织制片。以保存组织也不会影响组织制片。固定剂种类 醛类醛类 包括甲醛（福尔马林）和戊二醛，包括甲醛（福尔马林）和戊二醛，经醛固定的组织在蛋白质内形成交联，经醛固定的组织在蛋白质内形成

14、交联，在赖氨酸之间交联更明显。这种交联在赖氨酸之间交联更明显。这种交联不会破坏蛋白质的整体结构。不会破坏蛋白质的整体结构。免疫酶组织化学染色选用甲醛固免疫酶组织化学染色选用甲醛固定效果比较好。标准液是定效果比较好。标准液是10%10%中性缓冲中性缓冲福尔马林（福尔马林（NBFNBF）。）。缓冲液能防止福尔缓冲液能防止福尔马林变成酸性，酸性福尔马林液固定马林变成酸性，酸性福尔马林液固定组织会促进福尔马林色素的形成。组织会促进福尔马林色素的形成。戊二醛引起蛋白质戊二醛引起蛋白质-螺旋结螺旋结构变形，所以对免疫过氧化物酶染构变形，所以对免疫过氧化物酶染色不利。戊二醛通常用于电镜标本色不利。戊二醛通常

15、用于电镜标本的固定，但是，戊二醛对细胞浆和的固定，但是，戊二醛对细胞浆和核的细微结构固定效果较好。标准核的细微结构固定效果较好。标准固定液使用固定液使用2%2%戊二醛。戊二醛。汞类汞类 固定机理还不清楚，固定剂中含固定机理还不清楚，固定剂中含有氯化汞，最常用的是有氯化汞，最常用的是ZenkerZenker和和B-5B-5液，液，这类固定液穿透力差，并可引起一些这类固定液穿透力差，并可引起一些组织变硬，对胞浆及胞核的固定效果组织变硬，对胞浆及胞核的固定效果较好。较好。ZenkerZenker液是细胞学及病理学常液是细胞学及病理学常用的固定液，对细胞核固定最好，最用的固定液，对细胞核固定最好，最适

16、合于造血和网状内皮组织的固定。适合于造血和网状内皮组织的固定。由于由于ZenkerZenker和和B-5B-5固定液中含汞，所以，固定液中含汞，所以，固定后必须进行脱汞。固定后必须进行脱汞。 醇类醇类 醇包括甲醇和乙醇，醇是一种醇包括甲醇和乙醇，醇是一种蛋白质变性剂，经醇固定的组织容蛋白质变性剂，经醇固定的组织容易引起收缩，变硬，变脆，所以，易引起收缩，变硬，变脆，所以，醇一般不作为常规组织固定剂。但醇一般不作为常规组织固定剂。但是，乙醇对细胞学涂片固定效果非是，乙醇对细胞学涂片固定效果非常好，固定作用快，对细胞核的细常好，固定作用快，对细胞核的细微结构固定效果较好。微结构固定效果较好。氧化剂

17、类氧化剂类 包括高锰酸盐固定剂（高锰酸包括高锰酸盐固定剂（高锰酸钾），重铬酸盐固定剂（重铬酸钾）钾），重铬酸盐固定剂（重铬酸钾）和四氧化锇。它们交联蛋白质而引起和四氧化锇。它们交联蛋白质而引起广泛的变性。此类固定剂不常用，其广泛的变性。此类固定剂不常用，其中的一部分有特殊的用途。中的一部分有特殊的用途。苦味酸盐类苦味酸盐类 包括含有苦味酸的固定剂包括含有苦味酸的固定剂。这这类固定剂中最重要的有类固定剂中最重要的有BouinBouin液液，作作用机制不清楚用机制不清楚，BouinBouin液和汞固定剂液和汞固定剂一样对细胞核的成分保存较好一样对细胞核的成分保存较好，而而不会引起组织变硬不会引起组

18、织变硬。苦味酸干燥形苦味酸干燥形式存放容易爆炸式存放容易爆炸, ,为了安全常以饱和为了安全常以饱和液的方式饱存液的方式饱存。苦味酸液为一种黄苦味酸液为一种黄色液体色液体，凡是液体接触到的东西均凡是液体接触到的东西均被染成黄色被染成黄色，也包括皮肤也包括皮肤。影响固定的因素对组织固定可以产生影响的有以对组织固定可以产生影响的有以下几种主要因素。例如，缓冲作用、下几种主要因素。例如，缓冲作用、穿透力、固定液的剂量、温度、浓度、穿透力、固定液的剂量、温度、浓度、时间间隔等。缓冲液最好接近中性，时间间隔等。缓冲液最好接近中性，pHpH范围范围6-86-8。pHpH值低时组织的含氧量值低时组织的含氧量少

19、，所以在固定剂中应该有一定的缓少，所以在固定剂中应该有一定的缓冲能力，防止冲能力，防止pHpH值下降。酸性环境中值下降。酸性环境中有利于福尔马林色素的形成，在组织有利于福尔马林色素的形成，在组织中出现黑色沉积物。中出现黑色沉积物。常用的缓冲液有磷酸盐、碳酸盐、常用的缓冲液有磷酸盐、碳酸盐、二甲砷酸盐和巴比妥。通常使用二甲砷酸盐和巴比妥。通常使用pH7.0pH7.0磷酸盐缓冲液配制磷酸盐缓冲液配制10%10%甲醛固定甲醛固定液。液。固定液对组织的渗透作用依赖于每一固定液对组织的渗透作用依赖于每一种固定剂不变的扩散率。甲醛和乙醇种固定剂不变的扩散率。甲醛和乙醇的渗透力相对较好，戊二醛的渗透力的渗透

20、力相对较好，戊二醛的渗透力最差，其它固定液介于两者之间。组最差，其它固定液介于两者之间。组织块越薄固定液越容易渗透。织块越薄固定液越容易渗透。常规组织取材的厚度为常规组织取材的厚度为0.2-0.2-0.30.3cmcm，一般不超过一般不超过0.50.5cmcm。适当的取适当的取材厚度有利于固定液的渗透，良好的材厚度有利于固定液的渗透，良好的固定是组织制片和诊断研究工作必要固定是组织制片和诊断研究工作必要的基础。的基础。固定剂的容量要大，固定液与组固定剂的容量要大，固定液与组织块的比率应该大于织块的比率应该大于10:110:1，有时固定，有时固定的组织没有达到这个标准。补救的办的组织没有达到这个

21、标准。补救的办法是在组织固定期间更换法是在组织固定期间更换1-21-2次固定次固定液，避免固定剂耗尽失去固定作用。液，避免固定剂耗尽失去固定作用。另外，固定时使用振荡器处另外，固定时使用振荡器处于动态的固定液可以加快对组织于动态的固定液可以加快对组织的渗透作用，可以适当弥补固定的渗透作用，可以适当弥补固定液渗透力差固定液对组织渗透不液渗透力差固定液对组织渗透不足的缺陷。温度对组织固定的影足的缺陷。温度对组织固定的影响很明显，只要不是煮组织，不响很明显，只要不是煮组织，不管固定剂是属于哪种化学反应提管固定剂是属于哪种化学反应提高温度都会加速固定作用。高温度都会加速固定作用。固定剂的浓度在保证固定

22、作用固定剂的浓度在保证固定作用的基础上，将固定液的浓度尽可能的基础上，将固定液的浓度尽可能调到最低水平，这样会减少固定液调到最低水平，这样会减少固定液的浪费。甲醛比较合适的浓度为的浪费。甲醛比较合适的浓度为10%10%；戊二醛一般；戊二醛一般0.25-4%0.25-4%。浓度太。浓度太高相反可以影响组织而产生类似温高相反可以影响组织而产生类似温度过高的人为现象。度过高的人为现象。组织从切除到固定的间隔时组织从切除到固定的间隔时间也很重要，组织固定的越及时间也很重要，组织固定的越及时越好。新鲜标本不宜长时间暴露越好。新鲜标本不宜长时间暴露在空气中，如果无法及时固定，在空气中，如果无法及时固定，可

23、以先把组织保存在生理盐水中可以先把组织保存在生理盐水中送检。组织在干燥的空气中等待送检。组织在干燥的空气中等待的越久细胞器丢失的越多，细胞的越久细胞器丢失的越多，细胞核就会出现明显的皱缩，凝集现核就会出现明显的皱缩，凝集现象就会发生。象就会发生。固定液的选择 根据固定液的性质、组织的类根据固定液的性质、组织的类型和被证实的组织成分恰当地选用型和被证实的组织成分恰当地选用固定液。在制作固定液。在制作HEHE切片时，甲醛作切片时，甲醛作为尸检和活检组织的常规固定液。为尸检和活检组织的常规固定液。在所有固定剂中甲醛的应用范围最在所有固定剂中甲醛的应用范围最广，与其它固定液相比它是一种相广，与其它固定

24、液相比它是一种相对完美的固定剂。对完美的固定剂。甲醛固对组织不会有明显的甲醛固对组织不会有明显的损害。损害。10%10%中性缓冲福尔马林是一中性缓冲福尔马林是一种良好的常规固定液。此液是在低种良好的常规固定液。此液是在低渗缓冲离子中渗缓冲离子中pH6.8pH6.8。另外，人们另外，人们都非常熟悉甲醛，甲醛有一种令人都非常熟悉甲醛，甲醛有一种令人难以忍受的气味，在操作时大家都难以忍受的气味，在操作时大家都知道小心处理。知道小心处理。醛基础固定剂包括甲醛和多聚甲醛基础固定剂包括甲醛和多聚甲醛，多聚甲醛是甲醛以聚合物形式存醛，多聚甲醛是甲醛以聚合物形式存在的一种白色固体试剂。因为甲醛液在的一种白色固

25、体试剂。因为甲醛液中含有稳定剂甲醇对酶反应不利。在中含有稳定剂甲醇对酶反应不利。在一些酶组织化学反应时多选用一些酶组织化学反应时多选用4%4%多聚多聚甲醛固定。甲醛固定。4%4%多聚甲醛常用于动物灌注多聚甲醛常用于动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌固定及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡注后，然后取材，再用该液浸泡2-2-2424小时），多聚甲醛在组织形态学小时），多聚甲醛在组织形态学研究中被广泛应用。研究中被广泛应用。4%4%多聚甲醛也多聚甲醛也是免疫组织化学（原位杂交）研究是免疫组织化学（原位杂交）研究时首选固定剂。多聚甲醛（甲醛）时首选固定剂。多聚甲醛（甲醛）对于细

26、胞浆抗原和膜结合的免疫球对于细胞浆抗原和膜结合的免疫球蛋白具有稳定的固定效果。蛋白具有稳定的固定效果。厚度不超过厚度不超过0.30.3cmcm的小组织固的小组织固定定1-31-3小时。梢大点的组织固定小时。梢大点的组织固定6-6-1212小时。甲醛和多聚甲醛长时间固小时。甲醛和多聚甲醛长时间固定对组织抗原的保存不利。组织在定对组织抗原的保存不利。组织在醛基础固定液中停留的时间越长抗醛基础固定液中停留的时间越长抗原遮蔽越明显，抗原丢失的越多。原遮蔽越明显，抗原丢失的越多。在进行免疫组化染色时抗原性表达在进行免疫组化染色时抗原性表达就越弱。抗原修复可以适当弥补抗就越弱。抗原修复可以适当弥补抗原表达

27、较弱的缺点。原表达较弱的缺点。福尔马林福尔马林- -丙酮混合应用用于淋丙酮混合应用用于淋巴细胞标记物的固定。白细胞表面抗巴细胞标记物的固定。白细胞表面抗原常选用无水丙酮固定。原常选用无水丙酮固定。ZenkerZenker液适用于网状内皮组织包液适用于网状内皮组织包括淋巴结，脾，胸腺和骨髓的固定。括淋巴结，脾，胸腺和骨髓的固定。此固定液能使组织的胞核和胞浆得到此固定液能使组织的胞核和胞浆得到良好的固定。良好的固定。Zenker Zenker 液是一种良好的核固液是一种良好的核固定剂。该液是细胞学及病理学常用定剂。该液是细胞学及病理学常用的固定剂，最适合于造血和网状内的固定剂，最适合于造血和网状内

28、皮组织的固定。也常作为三色染色皮组织的固定。也常作为三色染色的组织固定剂，在三色染色中还作的组织固定剂，在三色染色中还作为媒染剂使用。但对于含血量较多为媒染剂使用。但对于含血量较多的组织尽量不要选的组织尽量不要选Zenker Zenker 液固定。液固定。含血量多的组织经含血量多的组织经Zenker Zenker 液固定液固定后会产生大量黑色的汞沉积物，不后会产生大量黑色的汞沉积物，不利于染色和观察。利于染色和观察。BouinBouin液被推荐用于睾丸，胃液被推荐用于睾丸，胃肠道和内分泌组织的固定。也常作肠道和内分泌组织的固定。也常作为媒染剂使用。对脂肪组织的固定为媒染剂使用。对脂肪组织的固定

29、效果较好，适用于含脂肪较多的组效果较好，适用于含脂肪较多的组织标本的固定。如含脂肪较多的淋织标本的固定。如含脂肪较多的淋巴结、脂肪瘤、乳腺组织等。有些巴结、脂肪瘤、乳腺组织等。有些资料表明资料表明BouinBouin液也常用于组织抗液也常用于组织抗原的保存。原的保存。BOUINBOUIN液（液（DUBOSCQ-BRAZIL DUBOSCQ-BRAZIL FLUIDFLUID）固定。该固定液不含汞，染色固定。该固定液不含汞，染色前不需要脱汞处理。前不需要脱汞处理。B-5B-5固定液常作为骨髓活检常规固定液常作为骨髓活检常规固定液，并且对淋巴结的固定效果也固定液，并且对淋巴结的固定效果也比较好。比

30、较好。戊二醛用于电镜组织标本的固定。戊二醛用于电镜组织标本的固定。戊二醛要用缓冲液配制并在戊二醛要用缓冲液配制并在44冰箱保冰箱保存，配制后一般保存存，配制后一般保存3 3个月。组织要新个月。组织要新鲜，为了增强固定，组织块最好不超鲜，为了增强固定，组织块最好不超过过1 1mmmm厚。厚。醇醇 特别是乙醇主要用于细特别是乙醇主要用于细胞学涂片的固定，胞学涂片的固定，95%95%乙醇固定速乙醇固定速度快而且便宜。因为涂片仅仅是度快而且便宜。因为涂片仅仅是细胞的厚度，涂片不是切片，在细胞的厚度，涂片不是切片，在固定时不会发生组织收缩和变脆固定时不会发生组织收缩和变脆的问题。的问题。冰冻切片常规染色

31、用甲醇和乙醇冰冻切片常规染色用甲醇和乙醇或福尔马林或福尔马林- -乙醇（乙醇（AFAF）固定最好，固定最好，你可以任选。你可以任选。丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂 系最初免疫系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。氯仿、甲醛等。丙

32、酮的组织穿透性和脱水性丙酮的组织穿透性和脱水性更强更强，常用于冰冻切片及细胞涂常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定片的后固定，保存抗原性较好保存抗原性较好。平时平时4 4保存备用保存备用，所谓冷丙所谓冷丙酮固定酮固定, ,临用时只需将涂片或冰冻临用时只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内切片插入冷丙酮内5-105-10minmin。取出取出后自然干燥后自然干燥，贮存于低温冰箱备贮存于低温冰箱备用用。以上介绍了免疫组织化学中以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳标本需经过反复试验，

33、选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无记结果可截然不同，致使人们无所适从。所适从。选择最佳固定液标准是：选择最佳固定液标准是：最好地保持细胞和组织的形态结构。最好地保持细胞和组织的形态结构。最大限度地保存抗原的免疫活性。最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，

34、中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。从而选出理想的标准固定液。常用固定液10%10%中性缓冲福尔马林中性缓冲福尔马林试剂：试剂：磷酸二氢钠（磷酸二氢钠（monohydratemonohydrate）4.0g4.0g磷酸氢二钠磷酸氢二钠 ( (anhydrous) 6.5ganhydrous) 6.5g甲醛甲醛 37% 37%100.0100.0mlml蒸馏水蒸馏水 900.0900.0mlml充分混合充

35、分混合 标记标记pHpH和日期和日期固定时间：固定时间：标本固定标本固定1-41-4小时小时/ /mmmm，大标本应大标本应延长固定时间延长固定时间。步骤：步骤：常规多数外科病理标本选用甲醛常规多数外科病理标本选用甲醛固定固定。组织脱水机前两个位置组织脱水机前两个位置最好使用中性福尔马林固定液最好使用中性福尔马林固定液。标本保存可以无限期的保持在标本保存可以无限期的保持在10%10%福尔马林中或转移到福尔马林中或转移到70%70%乙乙中中。Bouin Bouin 固定液固定液: :饱和苦味酸饱和苦味酸3000.03000.0mlml甲醛甲醛1000.01000.0mlml冰醋酸冰醋酸 200.

36、0200.0mlml小块组织固定小块组织固定2-42-4小时，大标本固定天。小时，大标本固定天。1.1.经过固定的组织可保持在经过固定的组织可保持在10%10%福尔马林福尔马林或或70%70%乙醇中。乙醇中。2.2.染色前脱掉组织中的苦味酸染色前脱掉组织中的苦味酸 3.3.自来水冲洗自来水冲洗 50%50%乙醇乙醇 或或70%70%乙乙醇饱和碳酸锂醇饱和碳酸锂乙醇乙醇BouinBouin液（液（DUBOSCQ-BRAZIL DUBOSCQ-BRAZIL FLUIDFLUID）用途：用于固定肾活检，组织学制备用途：用于固定肾活检，组织学制备固定液。固定液。试剂：试剂：乙醇乙醇BouinBouin

37、贮存液贮存液: :80%80%乙醇乙醇750.0750.0mlml甲醛甲醛300.0300.0mlml苦味酸苦味酸 5.05.0g g充分混合，液体稳定性充分混合，液体稳定性2 2年，标明配年，标明配制日期。制日期。工作液：工作液：贮存液贮存液70.070.0mlml14.0ml14.0ml醋酸醋酸5.05.0mlml10.0ml10.0ml使用前加醋酸。使用前加醋酸。固定时间：固定时间：1-41-4小时。小时。步骤：步骤： 把新鲜组织标本放进乙醇把新鲜组织标本放进乙醇BouinBouin工作工作液中。液中。充分固定后把组织移到充分固定后把组织移到70%70%的乙中。的乙中。HollandeH

38、ollande液液用途：作为胃肠和前列腺活检基本固用途：作为胃肠和前列腺活检基本固定剂，这种固定剂让定剂，这种固定剂让H.EH.E染色更清晰，染色更清晰，它它“软化软化”组织避免切片脆裂。苦味组织避免切片脆裂。苦味酸会溶解掉红细胞。酸会溶解掉红细胞。LillieLillie认为该液是一种很好的骨认为该液是一种很好的骨髓活检标本固定剂，固定液中的醋酸髓活检标本固定剂，固定液中的醋酸可以脱钙。可以脱钙。试剂：试剂：乙酸铜乙酸铜75.075.0g g蒸馏水蒸馏水 3000.03000.0mlml苦味酸苦味酸 120.0120.0g g甲醛甲醛 300.0300.0mlml冰醋酸冰醋酸45.045.0

39、mlml不要加热用蒸馏水溶解乙酸铜，慢不要加热用蒸馏水溶解乙酸铜，慢慢加入苦味酸，搅拌至溶解。加入慢加入苦味酸，搅拌至溶解。加入甲醛和醋酸。标明配制日期。甲醛和醋酸。标明配制日期。固定时间：固定时间：小标本小标本2-42-4小时，大标本小时，大标本4 4天。天。步骤：步骤：1.1.活检标本要立即放入活检标本要立即放入HollandeHollande固固定液中，标本容器上注明时间。定液中，标本容器上注明时间。2.2.标本完成固定后保持在标本完成固定后保持在70%70%乙醇乙醇中。中。3.3.不能让不能让HollandeHollande液固定的标本与液固定的标本与磷酸缓冲福尔马林接触，否则会磷酸缓

40、冲福尔马林接触，否则会出现蓝色沉淀。出现蓝色沉淀。4%4%多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液用途：进行免疫组织化学方法研究用途：进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。动物灌注固定时常选用该固定液。动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌注后，及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡然后取材，再用该液浸泡2-242-24小时）小时）也常选该固定液固定。也常选该固定液固定。试剂：试剂：多聚甲醛多聚甲醛4040g g 0.1 mol/L PH 7.4 PBS 0.1 mol/L PH 7.4 PBS 500 ml 500 ml 混合后加热至混合后加热至6060，搅拌并滴，搅拌并滴加加1 1

41、N NaOH N NaOH 至清亮为止，冷却后加至清亮为止，冷却后加PBS PBS 至总量至总量1000 1000 mlml。固定时间：固定固定时间：固定2424小时。小时。B-5B-5固定液固定液B-5B-5贮备液：贮备液：氯化汞氯化汞12.012.0g g醋酸钠醋酸钠 2.52.5g g蒸馏水蒸馏水 200.0200.0mlml充分混合，不使用任何金属用具或金充分混合，不使用任何金属用具或金属类盖子，贮备液自配制之日起稳定属类盖子，贮备液自配制之日起稳定性性1 1年。年。工作液：工作液：贮备液贮备液20.020.0ml,ml,甲醛甲醛2.02.0ml,ml,使用前立即使用前立即混合。混合。

42、固定时间：固定时间：2-42-4小时，在容器上注明时小时，在容器上注明时间，不要遗忘过夜。间，不要遗忘过夜。1.1.经过固定的标本保留在经过固定的标本保留在10%10%福尔马林福尔马林或或70%70%乙醇中。乙醇中。2.2.B-5B-5液固定的组织切片含有汞沉淀在液固定的组织切片含有汞沉淀在染色前必须进行脱色素处理（染色前必须进行脱色素处理（ 脱蜡后：脱蜡后： LugolLugols s碘：碘：5 5min,min,水洗。水洗。5%5%硫代硫代硫酸钠：硫酸钠：5 5min min ，水洗并按照染色步骤水洗并按照染色步骤要求进行染色）。要求进行染色）。Formalin-Alcoholic Sol

43、ution: Formaldehyde (37-40%) - 10 ml Ethanol (80%) - 90 ml Mix well. Carnoy Solution Ethanol (absolute) - 60 ml Chloroform - 30 ml Glacial acetic acid - 10 ml Mix well. Note: Used for fixation of DNA, RNA, Nissl granules and glycogen.Zenker Solution Mercuric chloride - 5 g Potassium dichromate - 2.5

44、 g Distilled water - 100 ml Heat - cool - filter in brown bottle. Add 5 ml of glacial acetic acid just before use. Wash fixed tissue in running tap water for 24 hours before dehydration. Never use metal forceps or metal container when handling tissues fixed in Zenker Solution. Note: Used for bloody

45、specimens such as spleen as well as connective tissues. Zinc Fixative 0.1M Tris Buffer, pH 7.4: Tris Base - 12.1 g (TRIZMA) 1N HCL - 81.5 ml Distilled water - 900 mlZinc Fixative: Calcium Acetate - 0.5 g Zinc Acetate - 5.0 g Zinc Chloride - 5.0 g 0.1M Tris Buffer made above - 1000 ml Mix to dissolve

46、. The final pH will be approximately 6.5-7.0. Do not readjust the pH, as this will cause the zinc to come out of solution. Store Zinc Fixative at room temperature. Fix tissues for 24 to 48 hours.HE染色石蜡包埋的组织切片必须经过脱石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。所以，

47、在染色前必须用行任何染色。所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。即组织切片乙醇洗后，再用水洗。即组织切片二甲苯二甲苯乙醇（无水乙醇，乙醇（无水乙醇，95%95%，80%80%）水。人们通常把这个过程叫做切片水。人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。脱蜡至水是染色前的必须脱蜡至水。脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。一般脱蜡至水的时完成的基本步骤。一般脱蜡至水的时间和步骤如下：间和步骤如下：脱蜡至水步骤脱蜡至水步骤1.1.二甲苯二甲苯、脱蜡脱蜡各各5 5minmin2.2.无水乙醇浸洗无水乙醇浸洗1 1minmin3.3.95%9

48、5%乙醇乙醇浸洗浸洗1 1minmin4.4.95%95%乙醇乙醇浸洗浸洗1 1minmin5.5.80%80%乙醇浸洗乙醇浸洗1 1minmin6.6.自来水冲洗自来水冲洗3-5 3-5 minmin冰冻切片和细胞涂片样品的染色不冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。接用苏木精和伊红染色。1.1.组织切片脱蜡至水组织切片脱蜡至水2.2.HarrisHarris苏木精液苏木精液3-5 3-5 minmin3.3.自来水洗自来水洗1 1 minmin4.4.70%70%盐酸乙醇液分化数秒钟盐酸乙醇液分化数秒钟5.5.自来水

49、流水冲洗自来水流水冲洗5 5 minmin至细胞核呈至细胞核呈蓝色，也可以使用蓝化液返蓝蓝色，也可以使用蓝化液返蓝0.5%0.5%伊红水溶液伊红水溶液1 1 minmin95%95%乙醇乙醇脱水脱水1 1 minmin95%95%乙醇乙醇脱水脱水1 1 minmin无水乙醇无水乙醇脱水脱水1 1 minmin无水乙醇无水乙醇脱水脱水2 min2 min二甲苯二甲苯透明透明2 min2 min二甲苯二甲苯透明透明2 min2 min中性树胶或中性树胶或DPXDPX封固封固结果结果: :细胞核蓝色，细胞浆红色，背细胞核蓝色，细胞浆红色，背景粉红色。景粉红色。Dissolve paraffin waxStain with Hematoxylin - blueWashStain with eosin - redNuclei - blueCytoplasm- redWashWhen dry, remove the wax, & stainthe section