1、 实验三、细胞的传代与冻存实验三、细胞的传代与冻存l1. 1.细胞培养中为什么添加血清？细胞培养中为什么添加血清？l2.2.使用血清需注意哪些方面？使用血清需注意哪些方面？l3.3.消化液胰酶的浓度是多少？消化液胰酶的浓度是多少？l4.4.使用小滤器过滤要注意哪些？使用小滤器过滤要注意哪些？ 针头滤器使用应注意的问题针头滤器使用应注意的问题 1. 1.拧紧滤器拧紧滤器 2.2.注射器吸液体注射器吸液体 3.3.注射器插好滤器注射器插好滤器 4.4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏对着烧杯慢推压针芯看是否漏 5.5.如不漏对小瓶过滤。如不漏对小瓶过滤。 6.6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，滤
2、器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。反复多次，滤完。 7.7.检查滤器滤膜是否完好。检查滤器滤膜是否完好。一、实验原理一、实验原理 细胞贴壁过程细胞贴壁过程培养细胞一代生长过程 什么时候传代？什么时候传代？ 细胞消化的最佳程度细胞消化的最佳程度 细胞冻存细胞冻存要求要求冻存条件冻存条件操作要点操作要点 二、实验目的 掌握无菌操作技术。 掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。 掌握培养细胞的消化方法。 了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。三、实验材料及设备三、实验材料及设备 1. 1. 细胞细胞 人宫颈癌人宫颈癌HeLaHeLa 细胞细胞 人胃癌人胃癌BGC-823
3、BGC-823细胞细胞2. 2. 试剂试剂 胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素 3. 3. 仪器仪器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品： 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75酒精棉球，酒精灯 四、实验步骤四、实验步骤1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下预热。3关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关,打开抽风机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒 。 4.正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉球、新洁尔
4、灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、 血清、胰酶等。5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6.将培养用液（90mL) 瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7. 打开血清（10.5mL) 瓶，瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。8. 无菌吸取10mL血清加入到培养液（90mL)中，用微量移液器加入双抗100L轻轻混匀，配置完全培养基。9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培养基轻轻混匀，加入0.5mL DMSO（冻
5、存保护剂），轻轻混匀即为冻存液 。10.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出）11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再加入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。12.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶13. 加两滴管（约1.8-2mL）冻存液既全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3106个/mL左右。14.将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并标记好细
6、胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液）15.在培养瓶(残余少量细胞）中加入5mL完全培养及，盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好记录，倒置相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2培养箱培养。16.冻存管在4度以下存放30min，转放到20度 1.52h，再转到70度412h后即可转移到液氮内，注意做好冻存记录。把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失。消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。不同细胞对消化反应不同。 贴壁不牢直接吹下细胞损伤注意事项注意事项1. 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤关键步骤? ?2.2.细胞胞传代培养的目的是什么细胞胞传代培养的目的是什么? ? 3.3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? ? 4.4.如何估计是否传代和传代的方式如何估计是否传代和传代的方式? ?5.5.细胞冻存应注意的问题。细胞冻存应注意的问题。思考题
