仪器分析高效液相色谱课件.ppt

1、第第10章章 高效液相色谱高效液相色谱10.1 概述概述10.2 HPLC 仪器仪器 包括：包括： 高压输液装置高压输液装置; 进样系统进样系统; 分离系统分离系统; 检测系统检测系统;辅助系统辅助系统10.3 流动相和固定相简介流动相和固定相简介10.4 高效液相色谱方法简述高效液相色谱方法简述 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱2022-6-1210.1 概述概述 高效液相色谱高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC） 是以溶剂液体为流动相的色谱方法。

2、是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：按照固定相不同可分为： 液液-液分配色谱；液分配色谱； 吸附色谱（液吸附色谱（液-固色谱）；固色谱）； 离子交换色谱；离子交换色谱； 尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱） 亲和色谱亲和色谱 平板色谱（薄层色谱）等。平板色谱（薄层色谱）等。 2022-6-13 早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径的工作，都是在直径15cm, 长长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在的固定相颗粒直径多在150200 m范围内

3、。即使这样，流速仍范围内。即使这样，流速仍然很低（然很低（7时，该检测器不够灵敏）。时，该检测器不够灵敏）。 其它检测器还包括：其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector（光散射）、极谱等。（光散射）、极谱等。2022-6-12910.3 HPLC 流动相和固定相简介流动相和固定相简介一、流动相一、流动相 与与GC 流动相不同，流动相不同，HPLC 流动相为溶剂，它既有运载作流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。对分离十分重要

4、。理想的溶剂应有下列特性：理想的溶剂应有下列特性：1）对待测物具一定极性和选择性；）对待测物具一定极性和选择性；2）使用）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长（为什检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长（为什么？）；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折么？）；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；增加；4）化学稳定性好；）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，产生气泡。）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，产生气泡。

5、2022-6-130二、固定相载体二、固定相载体 由于各种由于各种HPLC 分离方法的流动相均为液体，因此，分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC 通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。1. 按承受压力分按承受压力分刚性固体：刚性固体：二氧化硅二氧化硅为基质为基质 耐压为耐压为7.01081.0109 Pa 主要用于吸附、分配和键合色谱；主要用于吸附、分配和键合色谱；硬硬 胶：胶： 以以聚合物聚合物为基质（苯乙烯与二乙烯苯交联而成）为基质（苯乙烯与二乙烯苯交联而成） 耐压上限为耐压上限为3.5 108 Pa 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。主

6、要用于离子交换和尺寸排阻色谱。2022-6-1312. 按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型：表面多孔型：以以实心玻璃珠实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料（如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰孔活性材料（如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等）。表面多孔型固定相的颗粒大（易装柱）、多孔层厚胺等）。表面多孔型固定相的颗粒大（易装柱）、多孔层厚度小且孔浅（渗透性好，出峰快）；但交换容量小。适于常度小且孔浅（渗透性好，出峰快）；但交换容量小。适于常规分离分析。规分离分析。全多孔型：全多孔型：全部由全部由硅胶或氧化铝硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细

7、，微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、因而孔径小、传质快、 柱效高。特别适于复杂混合物的分离。柱效高。特别适于复杂混合物的分离。3. 按分离原理分：按分离原理分： 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱和色谱等等2022-6-13210.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论一、分配色谱一、分配色谱1. 原理：原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度溶解度不同，不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，

8、这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程不同，从而实现分离的过程。2022-6-1332. 流动相流动相: 为防止固定相的流失，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。或者说二者的极性相差越大越好。流动相与固定相极性的差别程度液液色谱分为：流动相与固定相极性的差别程度液液色谱分为： 正相分配色谱：正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离；的先流出，适于极性组分分离； 反相分配色谱：反相分配

9、色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。的先流出，适于非极性组分分离。2022-6-1343. 固定相：固定相： 原则上，用于原则上，用于GC 的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC 作固定相。作固定相。但但HPLC 固定液易流失，因此常用的只有几种固定液易流失，因此常用的只有几种- 按极性由高到低为：按极性由高到低为： , -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)。 涂渍方法的不同分为：涂渍方法的不同分为：机械涂渍型和化学键合型机械涂渍型和化学键合型，后者，后者

10、应用更为广泛。应用更为广泛。2022-6-1351）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型（表面多孔型（0.5-1.5%涂布量）或全多孔型载体（涂布量）或全多孔型载体（5-10%涂涂布量）上形成的液液色谱固定相。布量）上形成的液液色谱固定相。 最大的不足是：最大的不足是：固定液易流失、分离稳定性及重现性固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。差，不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置前置柱柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流，该柱涂

11、有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。2022-6-1362）化学键合固定相：）化学键合固定相： 通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成。具通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成。具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。 分离机理：分离机理：吸附和液液分配二者兼而有之吸附和液液分配二者兼而有之。化学键合的。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。 2022-6-137通常，化学键合相的通常，化学键合相的载体载体主要是主要是硅胶硅胶（表面有

12、硅醇基）：（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因 此只适于以不含水或醇的流动相。此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方 便。使用水溶液作流动相时，其便。使用水溶液作流动相时，其pH应在应在4-8之间。之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。范围内对水稳定。HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSiOHSi)(ROSiO

13、HROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22 硅硅烷烷化化方方法法三三酰酰氯氯化化方方法法二二硅硅酯酯化化方方法法一一或或2022-6-138固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18，硅胶硅胶-苯基；苯基； 流动相极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离解的化合物，如有机解的化合物，如有机有

14、机酸、有机酸、有有机机碱和酚碱和酚类类。 固定相极性固定相极性大大 硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 4. 正相和反相键合色谱法正相和反相键合色谱法 正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k 增加。增

15、加。1、在、在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐（碳酸铵、四烷基铵盐）或酸，分析中，有时要在流动相中加入适量的盐（碳酸铵、四烷基铵盐）或酸，为为 什么？什么？答：加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类答：加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类 待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。这些措施均可防止峰形拖尾。待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。这些措施均可防止峰形拖尾。2、何为正相色谱，何为反相色谱？、何为正相色谱，何为反相色谱？2022-6-139正相色谱：低极性流动相正相色谱：低极性流动相C先流出先流出反相色谱：高极

16、性流动相反相色谱：高极性流动相A先流出先流出中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系待测物极性：待测物极性：ABC2022-6-140时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长键合相

17、碳链越长（极性越小极性越小），分离效果越好。），分离效果越好。2022-6-141有机氯农药残留量分析： 固定相：薄壳型硅胶(3750 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50 cm2.5 mm(内径) 检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。多环芳烃分析： 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1 mL/min 柱 温：50C 柱 压：70104 Pa 检测器：紫外检测器1.苯2.萘3.联苯4.菲5.蒽6.荧蒽7.芘11.苯并芘12.苯并a芘1. 艾氏剂；2. p,p-DDT; 3.

18、p,p-DDT4. gama-六六六; 5. 蒽氏剂2022-6-142二、离子交换色谱二、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。核酸等。1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生实现分离

19、的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：可逆交换反应： 对阳离子，滞留时间从大到小的顺序为：对阳离子，滞留时间从大到小的顺序为：Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 对阴离子，滞留时间从大到小的顺序为：对阴离子，滞留时间从大到小的顺序为：柠檬酸根柠檬酸根, SO42-, C2O42-, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, H

20、COO-, CH3COO-, OH-, F- ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3阴离子交换阴离子交换阳离子交换阳离子交换2022-6-1432. 固定相固定相 按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂（包括微孔型和大孔型）；多孔型离子交换树脂（包括微孔型和大孔型）； 表面多孔型（包括薄膜型）离子交换树脂；表面多孔型（包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换

21、交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 2022-6-1441）多孔型：）多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯 + 二乙烯苯交联，分微孔型二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多和大孔型。交换基团多交换容量大，交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型 = 惰性核惰性核 + 树脂薄层树脂薄层(1-2 m) 多孔型多孔型 = 惰性核惰性核 + 树脂薄层树脂薄层 +硅胶微球。硅胶微球。 克服了多孔型离子交换树脂的不

22、足，克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：）离子交换键合相： 利用化学反应将离子交换基团键合到利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆2022-6-1453. 流

23、动相流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液（有一定离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度）和离子强度） ，通过改变，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，从而改变，从而改变交换剂的选择性、影响样品中待测物的分离。交换剂的选择性、影响样品中待测物的分离。pH值：值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、式存在时，则不被

24、保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比对保留值的影响比pH 更大更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对增加外加阴或阳离子将增加它们对R+ 或或R- 的竞争能力，使组分保留值减小。的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。同。有机溶剂：有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。外加有机溶剂

25、通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量当大量 L 和组分和组分 X 随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？离子交换色谱通常以什么为检测器？值及离子强度对分离

26、各有何影响？离子交换色谱通常以什么为检测器？2022-6-146三、离子色谱法三、离子色谱法 离子色谱（离子色谱（IC）是）是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用理一样，只是流出的各种离子用电导检测器电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。号。 为解决此问题，为解决此问题，1975年年Small 提出，在离子交换柱之后，再串结一根提出，在离子

27、交换柱之后，再串结一根抑制抑制柱柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的高容量的离子交换树脂。通过分离柱后。该柱装填与分离柱电荷完全相反的高容量的离子交换树脂。通过分离柱后的的“样品和流动相样品和流动相”再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。 例如：分析阳离子时，以例如：分析阳离子时，以无机酸无机酸为流动相，分离柱则采用为流动相，分离柱则采用阳离子交换剂阳离子交换剂，抑制柱为抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂高容量的强碱性阴离子交换树

28、脂，则发生下列反应：，则发生下列反应：R+OH + HCl(流动相流动相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待测物待测物) R+Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。的碱。 同样，若样品为阴离子，以同样，若样品为阴离子，以无机碱无机碱为流动相，分离柱则采用为流动相，分离柱则采用阴离子交换剂阴离子交换剂，抑制柱为抑制柱为高容量强酸性阳离子交换剂高容量强酸性阳离子交换剂。2022-6-147 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱

29、峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液（如因此有人提出了使用电导率很低的溶液（如苯甲酸盐稀溶液）作流动相。苯甲酸盐稀溶液）作流动相。思考：思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？采用抑制柱的优缺点是什么？采用抑制柱的优缺点是什么？阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(325 cm)流动相：0.003 M NaHCO3+ 0.0024 M Na2CO3，流量2.3 mL/min。 七种阴离子在20min内基本上得到完

30、全分离，各组分含量在350 ppm。2022-6-148四、离子对色谱法（四、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸或有机碱。离子对色谱主要用来分离强极性有机酸或有机碱。基本原理：将与待测物离子基本原理：将与待测物离子A电荷相反的离子电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）（称为对离子或反离子）加入到流动相（多为有机相）中，使待测离子加入到流动相（多为有机相）中，使待测离子A与对离子与对离子B形成离子对形成离子对AB，该，该AB离子对离子对的性质与的性质与A离子离子或或B离子离子的性质不同，即间接改变了的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。待测离子的保留特性。 例如：固

31、定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子入与待测离子A-有相反电荷的离子有相反电荷的离子B+： 由于离子对由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子离子A1，A2，A3.因与因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。的。 有机相有机相水相水相水相水相BABA2022-6-149阴离子分离阴离子分离：

32、常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；三甲铵作为对离子；阳离子分离阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱反相离子对色谱：非极性的疏水固定相：非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有对离子，含有对离子Y+的甲的甲醇醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，试样离子水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性进入流动相后，生成疏水性离子对离子对Y+ X -后；在两相间分配。后；在两相间分配。思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在

33、流思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？2022-6-150五、尺寸排阻色谱法五、尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱又称凝胶色谱，尺寸排阻色谱又称凝胶色谱，主要用于大分子的分子分离主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。包括凝胶过滤色谱（子的尺寸和形状不同来实现分离的。包括凝胶过滤色谱（GFC，以水为流动相）和，以水为流动相）和凝胶渗透色谱（凝胶渗透色谱（GPC，以有机溶剂为流动相），以有机溶剂为流动相）1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝

34、胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小分子大小(分子量大小分子量大小)先后从柱中流出。先后从柱中流出。2. 固定相固定相3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶润湿凝胶)、粘度小、粘度小(

35、增加扩散速度增加扩散速度)。 类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水 2022-6-151 六、

36、亲合色谱六、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。化的方法。分离原理：于载体表面先键合具有一分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，臂），然后再连接上配基，如酶、抗如酶、抗原或激素。原或激素。 当含有复杂混合试样的流动相流当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留

37、，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。的形式洗脱出来。特点：选择性过滤、纯化效果好。特点：选择性过滤、纯化效果好。2022-6-152 七、色谱分离方法的选择七、色谱分离方法的选择分子量分子量 水溶水溶性性 方方 法法 流动相流动相 可溶可溶 排阻色谱排阻色谱 水水 2000 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱 水水 分配色谱分配色谱(同系物同系物) 各种各种 吸附色谱吸附色谱(异构物异构物) 各种各种 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱(分子大小分子大小) 各种各种 反相液液色谱反相液液色谱 各

38、种各种 可溶但不解离可溶但不解离 排阻色谱排阻色谱 水水 阳离子交换色谱阳离子交换色谱(碱碱) 缓冲液缓冲液 可溶且不解离可溶且不解离 阴离子交换色谱阴离子交换色谱(酸酸) 缓冲液缓冲液 2000 可溶离子或非离子可溶离子或非离子 反相离子色谱反相离子色谱 缓冲液缓冲液 2022-6-1531（bar）=105（Pa） 1（dyn/cm2）=0.1（Pa） 1（Torr）=133.322（Pa） 1（mmHg）=133.322（Pa）1毫米水柱（毫米水柱（mmH2O）=9.80665（Pa） 1工程大气压工程大气压=98.0665（kPa） 1（kPa）=0.145磅磅/英寸英寸2（psi）=

39、0.0102（kgf/cm2） =0.0098（atm） 1磅磅/英寸英寸2（psi）=6.895（kPa）=0.0703（kg/cm2）=0.0689（bar）=0.068（atm）1物理大气压（物理大气压（atm）=101.325（kPa）=14.696磅磅/英寸英寸2（psi）=1.0333（bar）2022-6-154 液相色谱的柱子通常分为液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱正相柱和反相柱。 正相柱：正相柱：大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；等官能团的键合相硅胶柱； 反相柱：反相柱：填料主要以硅胶为基质，在其表

40、面键合非极性的填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（十八烷基官能团（ODS）称为）称为C18柱，其它常用的反相柱还柱，其它常用的反相柱还有有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚柱，聚合物填料柱等。合物填料柱等。液相色谱柱的选择、使用、维液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除护和常见故障及排除2022-6-155一、反相色谱柱的选择一、反相色谱柱的选择 1柱子的柱子的pH值使用范围值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，

41、使用时一定要注意流动相的胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。范围。一般的一般的C18柱柱PH值范围都在值范围都在2-8，流动相的，流动相的pH值小于值小于2时，会导致键合相的水解；时，会导致键合相的水解；当当pH值大于值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相谱柱不尽相同。如果流动相pH较高或经常使用缓冲液时，建议选择较高或经常使用缓冲液时，建议选择pH范围大的柱子，例如戴安公司的范围

42、大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱柱pH 2-9或或Zorbax的的pH 2-11. 5的柱子。的柱子。2填料的端基封尾（或称封口）填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。样品属酸性或碱性的化合物，最好选

43、用填料经端基封尾的色谱柱。2022-6-156二、液相色谱柱的使用二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。条件是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。 注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异

44、而有所不同。条件的差异而有所不同。1、样品的前处理：、样品的前处理：a）最好使用流动相溶解样品；）最好使用流动相溶解样品；b）使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆）使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质吸附的杂质c）使用）使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2022-6-1572、流动相的配制：、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备许多特点：达到分离的目的，因此要求流动相具备许多特点：a）流动相对样品具有一定的溶解能力

45、，保证样品组分不会）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）；沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）； b）流动相与样品不产生化学反应；）流动相与样品不产生化学反应；2022-6-158c）流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低）流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）；动相的黏度）；d）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制；检

46、测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制；e）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行；法进行；f）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。氧与样品发生作用。2022-6-1593、流动相流速的选择：、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱

47、，要追求最佳柱效得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。，最好使用最佳流速。 内径为内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择的色谱柱，流速一般选择1mlmin 内径为内径为4.0mm柱，流速柱，流速0.8mlmin为佳。为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。适当增加甲醇或乙腈的含量）。2022-6-160注意：注意：a）含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓

48、冲溶）含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不过夜。最好加入叠氮化钠，液作为流动相不过夜。最好加入叠氮化钠， 防止细菌生长。防止细菌生长。b）流动相要求使用）流动相要求使用0.45 m滤膜过滤，除去微粒杂质。滤膜过滤，除去微粒杂质。c）使用）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。谱柱的使用寿命，提高柱性能。2022-6-161三三 色谱柱的维护色谱柱的维护1、色谱柱的平衡、色谱柱的平衡 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。水中的。新柱应新柱应先

49、使用先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保你分析样品所使用的流动相和乙腈你分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。水互溶。操作步骤：操作步骤： a）平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直）平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）要较长的时间来平衡） b）如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水）如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡过渡”即每天分析开始前必须先用纯水冲洗即每天分析

50、开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。分钟保护柱子。2022-6-1622、色谱柱的再生、色谱柱的再生 长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。再生。 建议用来冲洗柱子的溶剂体积如下：建议用来冲