HA-HI试验课件.ppt

1、 病毒的红细胞病毒的红细胞凝集实验（凝集实验（HAHA）和凝集抑制实验和凝集抑制实验（HIHI）一、实验目的一、实验目的l1、掌握、掌握HA实验和实验和HI实验和操作方法。实验和操作方法。l2、掌握病毒凝集价（抗原效价）和凝集抑制价、掌握病毒凝集价（抗原效价）和凝集抑制价的判断。的判断。l3、掌握鸡心脏和翅静脉采血法。、掌握鸡心脏和翅静脉采血法。l4、掌握不同浓度红细胞悬液的制备。、掌握不同浓度红细胞悬液的制备。二、实验原理二、实验原理l某些病毒表面含有血凝素，能与鸡红细胞表面某些病毒表面含有血凝素，能与鸡红细胞表面的粘蛋白受体结合，使红细胞发生凝集，称为的粘蛋白受体结合，使红细胞发生凝集，称

2、为病毒的红细胞凝集现象，简称血凝现象。这种病毒的红细胞凝集现象，简称血凝现象。这种病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称病毒的红细胞凝集抑制现象（清所抑制，称病毒的红细胞凝集抑制现象（HIHI），简称血凝抑制现象。通过），简称血凝抑制现象。通过HA-HIHA-HI试验，可用试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 l该试验适合于血清中新城疫、禽流感及减蛋综该试验适合于血清中新城疫、禽流感及减蛋综合征抗体效价的检

3、测。合征抗体效价的检测。 三、在生产中的应用三、在生产中的应用l1、检测血清中的抗体水平，根据抗体效价的水、检测血清中的抗体水平，根据抗体效价的水平确定免疫时机。平确定免疫时机。l2、免疫后及时监测，确认免疫效果。、免疫后及时监测，确认免疫效果。l3、辅助诊断病毒性疾病、辅助诊断病毒性疾病 病毒凝集红细胞的特病毒凝集红细胞的特性能被对应的抗体抑制。性能被对应的抗体抑制。 四、实验材料四、实验材料l 以新城疫抗体效价检测为例以新城疫抗体效价检测为例l仪器：仪器：96孔孔V型微量反应板、振荡器型微量反应板、振荡器 1台（振荡台（振荡96孔孔V型板）型板） 、微量移液器等。、微量移液器等。l材料：新

4、城疫浓缩抗原、材料：新城疫浓缩抗原、1%的鸡红细胞悬液、的鸡红细胞悬液、生理盐水、待检鸡的血清。生理盐水、待检鸡的血清。 1%红细胞悬液制备红细胞悬液制备l 1、抗凝血的制备、抗凝血的制备 采集采集3只非免疫成年健康鸡血液只非免疫成年健康鸡血液，由翅静脉或心脏采血，按，由翅静脉或心脏采血，按3.8%柠檬酸钠与血液柠檬酸钠与血液1：4混合制成。混合制成。l2、1%红细胞悬液制备红细胞悬液制备 将抗凝血加入离心管内，将抗凝血加入离心管内，用生理盐水洗涤用生理盐水洗涤5次，每次次，每次2000r/min离心离心5min ，将血浆、白细胞充分弃去，最后一次离心时间为将血浆、白细胞充分弃去，最后一次离心

5、时间为10min，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红细胞体积，用生理盐水配制成细胞体积，用生理盐水配制成1%红细胞红细胞悬液。悬液。五、实验方法与步骤五、实验方法与步骤 l1、加稀释液、加稀释液 用微量移液器向反应板的第用微量移液器向反应板的第112孔各孔各加生理盐水加生理盐水50微升。微升。l2、首先用灭菌的生理盐水将鸡新城疫浓缩抗原作、首先用灭菌的生理盐水将鸡新城疫浓缩抗原作5倍稀释。然后用微量移液器吸取倍稀释。然后用微量移液器吸取5倍稀释的抗原倍稀释的抗原50微升于第一孔中，并反复吹打微升于第一孔中，并反复吹打45次，混匀后吸出次，混匀后吸出50微

6、升至第微升至第2孔，依次倍比稀释到第孔，依次倍比稀释到第11孔，从第孔，从第11孔吸出孔吸出50微升弃去；第微升弃去；第12孔不加抗原作为红细胞对孔不加抗原作为红细胞对照。照。 （一）血凝实验（一）血凝实验（HA)抗原稀释倍数抗原稀释倍数孔号孔号 123456789101112抗原抗原稀释稀释倍数倍数 21 2223242526272829210211对对照照 l3、加、加1%的鸡红细胞悬液的鸡红细胞悬液 用微量移液用微量移液器向器向112孔各加孔各加1%红细胞悬液红细胞悬液50微升微升。l4、置于微量振荡器上，振荡、置于微量振荡器上，振荡1分钟。分钟。l5、室温静置、室温静置1520分钟后观

7、察结果。分钟后观察结果。l6、结果观察：、结果观察： 方法方法1：从平面观察，红细胞为一：从平面观察，红细胞为一小圆点小圆点沉于孔底沉于孔底者，表明红细胞者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集未被或不完全被病毒凝集；如果；如果孔底的红细胞铺平孔底，孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层凝成均匀薄层，说明红，说明红细胞细胞被病毒所凝集被病毒所凝集。如下图。如下图 方法方法2：将反应板倾斜：将反应板倾斜45度角，沉于孔底的红细胞度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下沿着倾斜面向下呈线状流动者呈线状流动者，表明红细胞，表明红细胞未被或未被或不完全被病毒凝集不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，；如果孔

8、底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动红细胞不流动，说明红细胞，说明红细胞被病毒所凝集被病毒所凝集。如下图。如下图 7、判定结果、判定结果l（1）病毒凝集价（抗原效价）的判断：能使鸡）病毒凝集价（抗原效价）的判断：能使鸡红细胞红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数完全凝集的病毒最大稀释倍数，称为该病，称为该病毒凝集效价，以毒凝集效价，以2的指数表示。的指数表示。病毒凝集价为病毒凝集价为28l2、 4单位抗原的配制单位抗原的配制 凝集价稀释倍凝集价稀释倍数中所含病毒量为数中所含病毒量为1个凝集单位的病毒个凝集单位的病毒。凝集价前面第二孔所含病毒量为凝集价前面第二孔所含

9、病毒量为4单单位病毒位病毒。l抗原应稀释的倍数抗原应稀释的倍数=血凝滴度血凝滴度/4 例：上图抗原效价为例：上图抗原效价为28，也就是说在，也就是说在第第8孔中病毒的含量为孔中病毒的含量为1个凝集单位，个凝集单位，那么第那么第6孔中病毒的含量为孔中病毒的含量为4个凝集单个凝集单位。则位。则4单位抗原应将单位抗原应将原抗原原抗原作作26（64）倍稀释。即取）倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入毫升抗原，加入6.3毫升生理盐水。毫升生理盐水。五、实验方法与步骤五、实验方法与步骤 l1、加稀释液、加稀释液 用微量移液器向反应板的用微量移液器向反应板的第第112孔各加生理盐水孔各加生理盐水25微升。微升。

10、l2、倍比稀释被检血清、倍比稀释被检血清 用微量移液器吸用微量移液器吸取待测血清液取待测血清液25微升于第一孔中并反复微升于第一孔中并反复吹打吹打45次，混匀后吸出次，混匀后吸出25微升至第微升至第2孔，依次倍比稀释到第孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去孔，弃去25微微升；升；12孔不加血清作抗原对照。孔不加血清作抗原对照。（二）血凝抑制实验（二）血凝抑制实验（HI)血清稀释倍数血清稀释倍数孔号孔号 123456789101112血清血清稀释稀释倍数倍数 21 2223242526272829210211对对照照 l3、加、加4单位抗原单位抗原 112孔各加孔各加25微微升。升。l4、置于振荡器

11、上，振荡、置于振荡器上，振荡1分钟，分钟，室温静置室温静置 20分钟。分钟。l5、加、加1%的鸡红细胞悬液的鸡红细胞悬液 用微量用微量移液器向移液器向112孔各加孔各加1%红细胞悬红细胞悬液液25微升。微升。l6、置于振荡器上，振荡、置于振荡器上，振荡1分钟。分钟。室温静置室温静置2025分钟后观察结果。分钟后观察结果。l7、结果观察：、结果观察： 方法方法1：从平面观察，：从平面观察，如果红细胞为一小圆点如果红细胞为一小圆点沉于沉于孔底者，表明红细胞未被病毒凝集，即孔底者，表明红细胞未被病毒凝集，即凝集现象凝集现象被抑制被抑制；如果孔底的红细胞铺平孔底，；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀凝

12、成均匀薄层薄层，说明红细胞被病毒所凝集，即，说明红细胞被病毒所凝集，即凝集现象未凝集现象未被抑制被抑制。 方法方法2：将反应板倾斜：将反应板倾斜45度角，沉于孔底的红细胞度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被，表明红细胞未被病毒凝集，即病毒凝集，即凝集现象被抑制凝集现象被抑制；如果孔底的红细；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流倾斜后红细胞不流动动，说明红细胞被病毒所凝集，即，说明红细胞被病毒所凝集，即凝集现象未被凝集现象未被抑制。抑制。8、判定结果、判定结果 l（1）血清抗体效价的判断）血清抗体

13、效价的判断：能够使：能够使4单位病毒凝集鸡单位病毒凝集鸡红细胞的作用红细胞的作用完全完全被抑制的被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清最高稀释倍数，称为该血清的抗体效价，以血清的抗体效价，以2的指的指数表示。数表示。 上图，血清抗体效价依次为上图，血清抗体效价依次为28、 27、28、29、28、27、27、26孔号：孔号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 l2、判定标准：、判定标准： （1）一般认为鸡的免疫临界水平）一般认为鸡的免疫临界水平为为25（成鸡）或（成鸡）或26（雏鸡）。（雏鸡）。（2）鸡血清的凝集抑制价，全部）鸡血清的凝集抑制价，全部高于高于26可适当推迟新城

14、疫免疫时间可适当推迟新城疫免疫时间，全部低于，全部低于24以下，应马上进行新以下，应马上进行新城疫疫苗接种。城疫疫苗接种。 七、注意事项七、注意事项l1、制作、制作1%红细胞悬液所采用的鸡，应红细胞悬液所采用的鸡，应为未接种过新城疫疫苗的健康鸡。有抗为未接种过新城疫疫苗的健康鸡。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。l2、每加一种样品都要换一个移液器的、每加一种样品都要换一个移液器的滴头，以影响实验结果。滴头，以影响实验结果。l3、1%红细胞悬液红细胞悬液4保存，使用时轻保存，使用时轻轻摇匀，做同一次实验或测同一批样品轻摇匀，做同一次实验或测同一批样品不能更换

15、更换红细胞，正常保存不能更换更换红细胞，正常保存3天的天的红细胞不影响实验结果。红细胞不影响实验结果。七、注意事项七、注意事项l4 4、温度对试验结果也有影响，一般要、温度对试验结果也有影响，一般要求在室温求在室温25-3725-37进行实验，当温度低进行实验，当温度低于于44时红细胞有时会发生自凝现象。时红细胞有时会发生自凝现象。冬季做该实验时由于环境温度过低，最冬季做该实验时由于环境温度过低，最好将反应板置于好将反应板置于3030温箱中。温箱中。l5 5、9696孔孔V V型微量反应板是否洗净，是否型微量反应板是否洗净，是否光滑也会影响实验结果。光滑也会影响实验结果。9696孔微量反应孔微

16、量反应板的清洗方法：将浸泡有板的清洗方法：将浸泡有75% 75% 乙醇的棉乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板自来水冲洗反应板5 5次，再用蒸馏水冲次，再用蒸馏水冲洗洗3 3次以上，置次以上，置3737温箱中干燥。温箱中干燥。？思考题思考题l1、如何进行禽流感、如何进行禽流感H5、H9的抗体的抗体测定？测定？ 如果检测被检血清中禽流感如果检测被检血清中禽流感H5、H9的抗体效价，只需将新城疫抗原换的抗体效价，只需将新城疫抗原换为禽流感为禽流感H5、H9抗原即可，检测方抗原即可，检测方法完全相同。法完全相同。l2、怎样通过、怎样通过HI试验

17、鉴别新城疫和禽试验鉴别新城疫和禽流感？流感？八、实验后用具的处理八、实验后用具的处理l1、用过的反应板、微量滴头先用流水冲净，然、用过的反应板、微量滴头先用流水冲净，然后泡在清洁液中，后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中（遍，甩干，摆放在恒温箱中（ 70以下），烤以下），烤干备用。干备用。l2、清洁液的配制：重铬酸钾、清洁液的配制：重铬酸钾79克，水克，水1000ml，硫酸，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。时必须戴手套，口罩。