细菌内毒素和热原检查法讲解课件.ppt

1、l 郝树彬热原：注入人体后可引热原：注入人体后可引起发热反应的物质。起发热反应的物质。1 材料的致热性。材料的致热性。2 因微生物污染造成的热原反应因微生物污染造成的热原反应。l体内热原检查法兔温法（PT)l是一种体内的、全热原的检查方法。1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使用。l体外热原检查法（ITP)l是一种体外的利用人血细胞反应的全热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。l细菌内毒素检查法（BET)l医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热原。l内毒素热原l革兰氏阴性细菌细胞壁的组分l非内毒素热原l除内毒素外的热原热原检查法（家兔法）可用于检测热原检查法（家兔法）可用于

2、检测上述两种原因产生的热原反应。上述两种原因产生的热原反应。细菌内毒素检查法只检测产品的细细菌内毒素检查法只检测产品的细菌内毒素含量。菌内毒素含量。试验验证未发现输液器材料的致热试验验证未发现输液器材料的致热性，临床发生的热原反应均为细菌内毒性，临床发生的热原反应均为细菌内毒素污染造成的。因此对输液器成品可采素污染造成的。因此对输液器成品可采用细菌内毒素检查法进行热原初试。用细菌内毒素检查法进行热原初试。热原通常是指能够致热的微生物的尸热原通常是指能够致热的微生物的尸体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性细菌内毒素：主要存在于革兰氏

3、阴性细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。具有特别强的热原活性。热原的致热机理：细菌内毒素，热原的致热机理：细菌内毒素，病毒，细菌及其他微生物，类固醇或病毒，细菌及其他微生物，类固醇或某些材料释放热原质，作用于动物体某些材料释放热原质，作用于动物体单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内生性热原，作用于下丘脑使其产生内生性热原，作用于下丘脑体温调节中枢，结果使动物

4、体温升高。体温调节中枢，结果使动物体温升高。热原反应给临床治疗带来极大的危害，热原反应给临床治疗带来极大的危害，一般热原进入人体后数分钟至一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即小时内，即会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，故必须严格控制。故必须严格控制。细菌内毒素的理化性质细菌内毒素的理化性质1 耐热性：耐热性：180200摄氏度摄氏度2小时干热可小时干热可完全破坏。（药典为完全破坏。（药典为250摄氏度至少摄氏度至少1小时。）小时。） 2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。滤过性：体积极小，可通过普通滤器。3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水水溶性

5、：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。冲洗以除去热原。4 不挥发性不挥发性5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。被吸附性：可被树脂等吸附除去。6 被酸碱破坏被酸碱破坏7 被氧化剂破坏：被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡双氧水浸泡4小时，小时，可完全破坏。可完全破坏。l致热性l致死性l引起血液白细胞中的粒细胞下降l激活凝血系统l血压下降l诱导机体对内毒素的耐受l引起淋巴细胞的有丝分裂l诱导抗感染的非特异性l杀死肿瘤细胞l与鲎试剂反应细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法概述：概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今年发现并创造了鲎试验，至今仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效仍是国际上通用检测细菌

6、内毒素的最简便有效的方法，其优点在于：的方法，其优点在于：1 科学性：有生物化学的理论基础。科学性：有生物化学的理论基础。2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。高，重现性强。3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高，敏度极高，当内毒素量低到当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们浓度，它们都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。4 实用性：方法快速，操作简单，无实用性：方法快速，操作简单，无需特殊仪器设备，经济

7、实用。需特殊仪器设备，经济实用。由于细菌内毒素检查法的优越性，已由于细菌内毒素检查法的优越性，已被广泛应用于临床检验。被广泛应用于临床检验。实验目的：实验目的：据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断医疗器械或其浸反应的机理，以判断医疗器械或其浸提液中细菌内毒素的限量是否符合规提液中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，医疗器械定的一种方法，医疗器械/材料须经热材料须经热原实验评价证实无材料致热性，同时原实验评价证实无材料致热性，同时经测定证实样品对细菌内毒素试验无经测定证实样品对细菌内毒素试验无干扰作用后，才能采用该方法。干扰作用后，才能采用该方法。细菌内

8、毒素在钙离子，镁离子参细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中与下，激活鲎试剂中c因子，活化的因子，活化的c因因子激活子激活b因子，活化的因子，活化的b因子激活凝固因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。内毒素内毒素C因子因子活化活化c因子因子B因子因子活化活化b因子因子凝固酶元凝固酶元凝固酶凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白凝固蛋白凝胶凝胶某些非热原物某些非热原物质质G因子因子活化活化g因子因子实验试剂实验试剂：鲎试剂鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物是从栖生于海洋的无脊椎动物“

9、鲎鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示。浓度表示。鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。须是统一且标准的。l细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素，单位：提取精制得到的内毒素，单位：EU.l用于标定细菌内毒素工作标

10、准品和标定，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。仲裁鲎试剂灵敏度。l细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其效国家标准品为基准进行标定，确定其效价。具备均一性和稳定性。价。具备均一性和稳定性。细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水：指与灵敏度为指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度或更高灵敏度的鲎试剂在的鲎试剂在371条件下条件下24小时不产生小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。凝集反应的灭菌注射用水。移液管（或刻度吸管，定量移液移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（器）、凝集管（10107575mmmm）、）

11、、三角瓶、三角瓶、小试管（小试管（1616100100mmmm）、）、试管架、洗耳试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃器皿须经器皿须经180180干烤至少干烤至少2 2小时。塑料小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。方法。l75%75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。 l试验准备试验准备l洗液的配备配制铬酸洗液或其他适宜洗液的配备配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。的细菌内毒素灭活剂。l玻璃器皿的洗涤将洗涤的玻璃器皿用玻璃器皿的

12、洗涤将洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡液中浸泡4 4小时，取出，用自来水将残余小时，取出，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置箱后将烤箱调至素，玻璃器皿置箱后将烤箱调至180180，待烤，待烤箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少2 2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自小时。达到时间后，

13、关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。性内毒素。塑料制品清洗干净后在塑料制品清洗干净后在30双氧水中双氧水中浸泡浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在再用无热原水充分冲洗后在60烘箱烘箱中烘干备用中烘干备用 。l内毒素标准溶液的制备内毒素标准溶液的制备l取取NSENSE或或WSEWSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%75%酒精酒精棉球擦拭后启开

14、，防止玻璃屑落入瓶内。棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。l按标准品使用说明书用移液管加入规定量的按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BETBET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合置旋涡混合器上混合1515分钟，然后制备成所需分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即浓度的细菌内毒素标准溶液即2.02.0、1.0 1.0 ,0.5 , 0.25,0.5 , 0.25（为所复核鲎试剂的标为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合混合3030秒（详细过程请参见使用说明书）。秒（

15、详细过程请参见使用说明书）。l例如使用例如使用NSE(NSE(内毒素含量为内毒素含量为90009000EU/EU/支支) )时的方时的方法如下：法如下：l溶解溶解：准确吸取：准确吸取BETBET水水1 1mlml加入加入NSENSE的安瓿内，的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合1515分钟，即为分钟，即为90009000EU/mlEU/ml内毒素标准溶液。内毒素标准溶液。l稀释稀释：取：取0.30.3mlml内毒素标准溶液加上内毒素标准溶液加上2.72.7ml BETml BET水即为水即为110110稀释液，得到稀释液，得到900900EU/ml

16、EU/ml内毒素标内毒素标准溶液。准溶液。取取0.30.3mLmL 110 110稀释液，加上稀释液，加上2.72.7mLmL BETBET水即为水即为11001100稀释液，得到稀释液，得到9090EU/mlEU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式写成下列格式：l9000EU/ml 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/mll在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混合器上混合合器上混合3030秒钟秒钟。

17、0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1mll在制备内毒素标准溶液的同 时 ， 取在制备内毒素标准溶液的同 时 ， 取0.10.1ml/ml/支的鲎试剂支的鲎试剂1818支轻弹瓶壁，使粉支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，75%75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.10.1mlBETmlBET水，使鲎试剂充分溶解，避免水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。产生气泡。l若待复核鲎试剂的规格不是若待复核鲎试剂的规格不是0.10.1ml/ml/支时，按标示量加入支时，按标示量加入BETBET水溶解，将水溶解，将溶解

18、后的鲎试剂溶液混匀后每溶解后的鲎试剂溶液混匀后每0.10.1mlml分配到分配到10107575mmmm凝聚管中，要求至凝聚管中，要求至少分配少分配1818管备用管备用。将已充分溶解的待复核鲎试剂将已充分溶解的待复核鲎试剂1818支支( (管管) )放放在试管架上，排成在试管架上，排成5 5列，其中列，其中4 4支支( (管管)4)4列列分别加入分别加入2.02.0、1.01.0、0.50.5、0.250.25的内毒素标准溶液；的内毒素标准溶液；2 2支支( (管管)1)1列分别加入列分别加入 BETBET水，作为阴性对照。内毒素标准溶液水，作为阴性对照。内毒素标准溶液和和BETBET水加样量

19、均为水加样量均为0.10.1ml/ml/支。支。结果判定：结果判定：将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持完整 并 从 管 壁 滑 脱 者 为 阴 性 ， 记 录 为完整 并 从 管 壁 滑 脱 者 为 阴 性 ， 记 录 为（）。（）。如最大如最大2.02.0浓度管均为阳性，最低浓度浓度管均为阳性，最低浓度0.250.2544管均为阴性，阴性对照为阴性，管均为阴性，阴性对照为阴性， 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为按下

20、式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（鲎试剂灵敏度的复核结果（c c）。）。cclglg-1-1(X/4) (X/4) 式中式中X X为反应终点浓度的对数值（为反应终点浓度的对数值（lglg）。）。反反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后四个呈阳性的结果浓度。四个呈阳性的结果浓度。阴性0.50.250.1250.0625-+-+-+-+-内毒素稀释液浓度内毒素稀释液浓度 d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103lX=2.10721l=lg=lg-

21、1-1(-2.10721/4)=0.297(-2.10721/4)=0.297l测定值在标示值的测定值在标示值的50%50%200%200%之间，之间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎试所标示灵敏度可被确认，此批鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素检查。剂可用于供试品的细菌内毒素检查。l内毒素限值的确定内毒素限值的确定l一次性使用输液器内毒素限值为一次性使用输液器内毒素限值为20EU/套套（GB/T14233.2-2005)l供试品溶液的制备供试品溶液的制备l每批输液器取每批输液器取3套，管内腔注入细菌内毒套，管内腔注入细菌内毒素检查用水素检查用水10mL，反复荡洗反复荡洗5次后，两次后，两端封闭，置端

22、封闭，置37 下下 2h，将腔内的液体倒将腔内的液体倒入一无菌无热原玻璃容入一无菌无热原玻璃容 器内。器内。l举例：所用鲎试剂标示灵敏度为举例：所用鲎试剂标示灵敏度为0.25EU/ml,则阳性对照溶液的细菌内毒则阳性对照溶液的细菌内毒素浓度为素浓度为0.5EU/ml.l阳性对照溶液的制备用细菌内毒素检阳性对照溶液的制备用细菌内毒素检查用水制成查用水制成2浓度的细菌内毒素溶液。浓度的细菌内毒素溶液。l鲎试剂制备鲎试剂制备l在制备供试品溶液、内毒素标准溶液的在制备供试品溶液、内毒素标准溶液的同时，取同时，取0.1ml/支的鲎试剂支的鲎试剂6支，手指轻支，手指轻弹瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，弹

23、瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入加入0.1ml/支水溶解，轻轻转动瓶壁，使支水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。内容物充分溶解，避免产生气泡。l若使用的鲎试剂的规格不是若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，支时，按标示量加入按标示量加入BET水复溶，将溶解后的水复溶，将溶解后的鲎试剂液混匀后每鲎试剂液混匀后每0.1ml分配到分配到1075m m凝集管中，要求至少分配凝集管中，要求至少分配6管备用。管备用。 l使用鲎试剂的灵敏度标示

24、值小于供试品使用鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的细菌内毒素限量时，用检查用水将供的细菌内毒素限量时，用检查用水将供试液稀释后进行试验，公式如下：试液稀释后进行试验，公式如下：l供试液稀释倍数供试液稀释倍数=X/ lX X供试品的细菌内毒素限量供试品的细菌内毒素限量l使用鲎试剂的灵敏度标示值使用鲎试剂的灵敏度标示值l取装有取装有0.1ml鲎试剂溶液的鲎试剂溶液的1075mm试管或复试管或复溶后的溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿支规格的鲎试剂原安瓿8支。支。l2支加入支加入0.1ml按按最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数稀释的供试稀释的供试品溶液作为供试品试管。品溶液作为供试品试管。l 2支加

25、入支加入0.1ml 2浓度的内毒素溶液作为阳性浓度的内毒素溶液作为阳性对照。对照。l2支加入支加入0.1ml BET水作为阴性对照。水作为阴性对照。l2支加入支加入0.1ml 含含2浓度的内毒素的供试品溶液浓度的内毒素的供试品溶液作为供试品阳性对照作为供试品阳性对照编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液2C2/检查用水检查用水2D无/检查用水2注：注：A为供试品溶液；为供试品溶液；B为供试品阳性为供试品阳性对照；对照；C为阳性对照；为阳性对照；D为阴性对照为阴性对照l将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放

26、入闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒水浴或适宜恒温器中，试管保持水平状态保温温器中，试管保持水平状态保温602分分钟。保温和拿取试管过程应避免震动钟。保温和拿取试管过程应避免震动。 l将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。为（）。 l阳性对照阳性对照2管应均为（），管应均为（），l供试品阳性对照供试品阳性对照2管应均为（），管应均为（），l阴性对照阴性对照2管应均为（）。管应均为（）。l否则实验无效。否则实验无效。l供试品供试品2管均为管均为(),判定该批产品符合本法规判定该批产品符合本法规定。定。l供试品供试品2管均为（），则判定该批产品不管均为（），则判定该批产品不符合本法规定，或再进行热原检查法试验。符合本法规定，或再进行热原检查法试验。l如只有一管为阳性则按上述方法另取四支供如只有一管为阳性则按上述方法另取四支供试品管复试，四支中有一支为阳性则不符合试品管复试，四支中有一支为阳性则不符合规定，或再进行热原检查法试验。规定，或再进行热原检查法试验。