第六节-双脱氧末端终止测序法原理-过程和目标基因课件.ppt

1、1双脱氧末端终止法测序的原理、双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析过程和目标基因序列的分析2 DNA测序技术主要有两种方法，都是在测序技术主要有两种方法，都是在20世世纪纪70年代中期发明的。年代中期发明的。 A. 双脱氧链终止法双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过），是通过合成合成与单链与单链DNA互补的多核苷互补的多核苷酸链来读取待测酸链来读取待测DNA分子的顺序分子的顺序。 B. 化学降解法化学降解法（chemical degradation method），），是将双链是将双链DNA分子用化学试剂处理，分子用化学试剂处理，产

2、生切口产生切口，用同位素标记进行测序。用同位素标记进行测序。一、一、DNA测序的方法测序的方法31. Sanger双脱氧链终止法测序原理双脱氧链终止法测序原理 利用利用DNA聚合酶和聚合酶和双脱氧链终止物测定双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家学实验室的生物化学家F. Sanger等人于等人于1977年年发明的。发明的。4基本原理：基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；分子； 利用利用DNA聚合酶不能够区聚合酶不能够区分分dNTP和和

3、ddNTP的特性，的特性，使使ddNTP参入到寡核苷酸链参入到寡核苷酸链的的3-末端。因为末端。因为ddNTP 3不不是是-OH，不能与下一个核苷，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。链的增长。562、具体操作：具体操作： 测序时分成四个反应测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外每个反应除上述成分外分别加入分别加入2,3-双脱氧的双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称核苷三磷酸（称为为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚然后进行聚合反应。在第一个反应中合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替会随机地代替dATP参

4、加反应，一旦参加反应，一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的DNA链，由于其第链，由于其第3位的位的-OH变成了变成了-H, 所以不能所以不能继续延伸继续延伸,于是第一个反应中所产生的于是第一个反应中所产生的DNA链都是链都是到到A就终止了。就终止了。7 同理第二个反应产生的都是以同理第二个反应产生的都是以C结结尾的尾的; 第三个反应的都以第三个反应的都以G结尾结尾, 第四个第四个反应的都以反应的都以T结尾结尾, 电泳后就可以读出序电泳后就可以读出序列了列了.8 假如有一个假如有一个DNA, DNA, 互补序列是互补序列是GATCCGAT, GATCCGAT, 我们试着做一下我们试着做一下

5、: : 在第一个反应中由于含有在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题三个碱基时没什么问题, 但遇到但遇到A时时, 掺入的可能是掺入的可能是dATP或或ddATP, 比如已合成到比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是下一个如果参与反应的是ddATP则终则终止止, 产生一个仅有产生一个仅有2个核苷酸的序列个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸否则继续延伸, 可以可以产生序列产生序列GATCCG, 又到了下一个又到了下一个A了了. 同样有两种情况同样有两种情况, 如果如果是是ddATP掺入掺入, 则产生的序列是则产生的序列是GATCCG

6、A, 延伸终止延伸终止, 否则可否则可以继续延伸以继续延伸, 产生产生GATCCGAT. 将得到如下结果：将得到如下结果：1产生的都是以产生的都是以A A结尾的片段结尾的片段: GA,GATCCGA: GA,GATCCGA。234产生的都是以产生的都是以C C结尾的片段结尾的片段: GATC, GATCC: GATC, GATCC产生的都是以产生的都是以G G结尾的片段结尾的片段: G, GATCCG: G, GATCCG 产生的都是以产生的都是以T T结尾的片段结尾的片段: GAT, GATCCGAT: GAT, GATCCGAT9 制得的四组混合制得的四组混合物全部平行地点加在物全部平行地

7、点加在变性聚丙烯酸受凝胶变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组每组制品中的各个组分将按其链长的不同分将按其链长的不同得到分离，从而制得得到分离，从而制得相应的放射性自显影相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即图谱。从所得图谱即可直接读得可直接读得DNADNA的碱的碱基序列。基序列。 即可得到测序结果：为即可得到测序结果：为GATCCGAT10制备单链模板制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火 加入加入DNA多聚酶多聚酶4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分别加入少量分别加入少量4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 将将4种反应产物分别在种反应产物分别

8、在4条泳道电泳条泳道电泳 根据根据4个碱基在个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列3、技术路线：技术路线：114、 高通量自动化测序高通量自动化测序 DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指方面是指“分析反应分析反应”的自动化，另一方面是指的自动化，另一方面是指“读片过程读片过程”的自动化。的自动化。 自动化的自动化的DNA 序列分析，也是根据序列分析，也是根据Sanger 双双脱氧链终止脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。测序法的基本原理发展起来的。12自动化测序原理自动化测序原理 自动化测序类似于自动化测序

9、类似于PCR反应，反应，但只用一条引物，反应混合物中但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的含有不同荧光标记的ddNTP与与4种种dNTP。由于每种。由于每种ddNTP带有带有各自特定的荧光颜色各自特定的荧光颜色,而简化为而简化为由由1个泳道同时判读个泳道同时判读4种碱基。产种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。号，由计算机判读并记录。 优点优点 ：可用双链：可用双链DNA做模板；做模板；模板用量少，不必克隆；可实现模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。高通量自动化。13高速自动高速自动DNA测序仪的结构及工作原理测序仪的结构及工作

10、原理 由激光发射器产生的激由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统光束，通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。后被导向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的同经过检测孔的DNA片段片段发生作用，并提供能量激发发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通性波长的荧光。这些荧光通过聚焦镜集中后传给滤光镜过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。传送给计算所分析处理。14 荧光化合物标记荧光化合物标记链终止法以荧光颜色链终止法以荧光颜色为标记信号，每种为标记信号，每种ddNTP各有各有1种代表种代表颜色；整个反应在一颜色；整个反应在一个试管中进行；当新个试管中进行；当新合成的终止单链通过合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。酸并由电脑记录。1516Sanger双脱氧链终止双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：测序法的测序能力： 手工测序：最大约手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约自动测序：最大约1200 bp。