生化-蛋白质分离纯化技术.课件.ppt

1、蛋白质的分离、纯化和结构分蛋白质的分离、纯化和结构分析析2401120102黄嵩v蛋白质分离指利用其理化性质，采取透析、盐析、电泳、层析以及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构域功能的需要一、透析和超滤法可除去蛋白质溶液中的小分子化合物 利用透析袋分离蛋白质的方法叫透析发，透析袋是具有超小微孔的膜，一般只允许分子量为10kD以下的化合物通过，高分子蛋白则留在袋内二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀法v丙酮沉淀：在丙酮沉淀：在04时，用时，用10倍于蛋白质溶倍于蛋白质溶液体积的丙酮加入到蛋白质溶液中，形成液体积的丙酮加入到蛋白质溶液中，形成沉淀后，立即分离，防止蛋白质变性沉淀后

2、，立即分离，防止蛋白质变性v盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为沉淀析出的过程称为“盐析盐析”，它属于沉，它属于沉淀法，目的是将所需要的蛋白质转入固相淀法，目的是将所需要的蛋白质转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离离v免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应抗原免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应抗原蛋白质，以形成复合物从而分离蛋白质蛋白质，以形成复合物从而分离蛋白质三、利用电泳法分离蛋白质v电泳（electrophoresis）在外电场作用下，带电蛋白质将向与其电性相反的电极移动的现象一般不用于纯化大量蛋

3、白质，常作为一种分析手段1) 1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)v聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），它以），它以聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶作为支作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。基催化完成。vSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量： 使用含有使用含有十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（ SDSSDS

4、）和还原和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸白质样品进行处理（一般煮沸3 35 5分钟），分钟），通过加热和通过加热和SDSSDS可以使蛋白质变性，多亚基可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）原）2) 2) 等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing） 利用聚丙烯酰胺凝胶内利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一凝胶内沿电场方向制造一

5、个个pHpH梯度。梯度。 每种蛋白质都将迁移至每种蛋白质都将迁移至与它的与它的pIpI 相一致的相一致的pHpH处。处。Isoelectric focusing. This technique separates proteins according to their isoelectric points. 四、相分配或亲和原理分离蛋白质四、相分配或亲和原理分离蛋白质层析技术，亦称色谱技术，是利用混合物中各组分的物理、化学、生物性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中（其中一个相为固定的，称为固定相；另一个相则流过此固定相，称为流动相）并使各组分以不同速率随流动相移动，从而达到分离各组分的

6、效果。(1) (1) 离子交换层析离子交换层析（ion-exchange chromatography)利用一定利用一定pHpH下不同蛋白质带电种类和电量的差下不同蛋白质带电种类和电量的差异，柱介质是结合着带电基团的合成聚合物。异，柱介质是结合着带电基团的合成聚合物。结合着阴离子的称为阳离子交换树脂结合着阴离子的称为阳离子交换树脂(cation(cation exchanger), exchanger), 结合阳离子的称为阴离子交换树结合阳离子的称为阴离子交换树脂脂(anion exchanger)(anion exchanger)。v离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂离子交换

7、层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。的结合力不同而进行分离纯化的。v离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。上某种电荷基团形成的。+-电荷基团电荷基团平衡离子平衡离子-高分子聚合物基质高分子聚合物基质(2)(2) 凝胶过滤（凝胶过滤（gel filtration chromatography）凝胶层析是按照蛋白质分子量大小凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过

8、滤、进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析分子筛层析或排阻层析 Gel filtration. This method separates proteins according to size. 柱床体积为柱床体积为Vt外水体积为外水体积为Vo内水体积为内水体积为Vi基质体积为基质体积为Vg，则有：则有： VtVoViVg 由于由于Vg相对很小，可以相对很小，可以忽略不计，则有：忽略不计，则有： VtVoVi 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积五、超速离心分离五、超速离心分离v超速离心法即可以用来分离纯化蛋白质也可超速

9、离心法即可以用来分离纯化蛋白质也可以用来测定蛋白质的分子量以用来测定蛋白质的分子量v蛋白质在高达蛋白质在高达50万万g(g为为gravity)的重力作用的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力等于离下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力等于离心力时，沉降停止心力时，沉降停止v蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示 沉降系数：沉降系数：生物大分子、亚细胞器和微生物等颗粒在单位离心生物大分子、亚细胞器和微生物等颗粒在单位离心场中的沉降速度为沉降系数（场中的沉降速度为沉降系数（s s）。单位用）。单位用S S，即，即SvedbergSvedberg单位，单位，为为1 1

10、1010-13-13秒。秒。（m mp p：颗粒质量；：颗粒质量；v v ：偏微比容；：偏微比容； ：溶剂密度；：溶剂密度；f f：摩擦系数）：摩擦系数） S S与颗粒的质量和密度、溶剂的密度和粘度有关，可根据沉降与颗粒的质量和密度、溶剂的密度和粘度有关，可根据沉降系数的不同来分离和检定生物大分子、亚细胞器和微生物。系数的不同来分离和检定生物大分子、亚细胞器和微生物。fvmxdtdxp)1 (/s2六、应用化学或反向遗传法分析多肽六、应用化学或反向遗传法分析多肽链氨基酸序列链氨基酸序列v第一步：分析蛋白质的氨基酸残基v第二步：测定多肽链的氨基末端和羧基末端的氨基酸种类v第三步：将肽链水解成片断

11、，分别进行分析，然后测定各肽段的氨基酸排序，一般采用Edman降解法v第四步：整合对比，得出肽链氨基酸排序v近年来也可以通过核酸来推演氨基酸排序七、应用物理学、生物信息学原理测七、应用物理学、生物信息学原理测定蛋白质空间结构定蛋白质空间结构v通常采用圆二色光谱通常采用圆二色光谱(circular dichroism,CD)测定溶液状态下的蛋白质二测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量级结构含量vX射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振和核磁共振技术技术(nuclear magnetic resonance,NMR)研究蛋白质三维空间结构研究蛋白质三维空间结构v近年建立

12、起来的二维核磁共振技术也已用于近年建立起来的二维核磁共振技术也已用于测定蛋白质三维结构测定蛋白质三维结构v目前几种测定蛋白质结构的方法目前几种测定蛋白质结构的方法1、同源建模、同源建模 被认为是目前最精确的方法被认为是目前最精确的方法2、折叠识别、折叠识别 通过预测二级结构、预测折叠通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其他蛋白质的空间结构，从而产方式和参考其他蛋白质的空间结构，从而产生目标序列的三维结构生目标序列的三维结构3、从无到有、从无到有 根据单个氨基酸形成二级结构根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列的三维结构生目标序列的三维结构谢谢大家谢谢大家黄嵩黄嵩