核酸的分离与纯化.课件.ppt

1、 前言前言1 1 核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则1.1 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性1.2. 1.2. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解2 2 分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤2.1 2.1 细胞的破碎细胞的破碎2.2 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除2.3 2.3 核酸的沉淀核酸的沉淀2.4 2.4 核酸的浓度测定核酸的浓度测定2.5 2.5 核酸的保存核酸的保存 核酸核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构

2、还是功能研究，首先无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前前 言言Home1.1 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性1.1.1 1.1.1 意义：意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的核酸的级结构还决定其高级结构的形式以及级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。和其他生物大分子结合的方式。1.1.2 1.1.2 分离核酸原则：分离核酸原则： 1 1）温度）温度不要过高；不要过高； 2

3、2）控制控制pHpH值值范围范围(pH(pH值值5-9); 5-9); 3 3）保持一定保持一定离子强度离子强度; ; 4 4）减少物理因素对核酸的减少物理因素对核酸的机械剪切力机械剪切力. .Home 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温所用器械和一些试剂需高温灭菌灭菌，提取缓，提取缓冲液中需加冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。(1(1） 金属离子螯合剂：金属离子螯合剂： DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，

4、因的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。酶活性。如如EDTA-NaEDTA-Na2 2( (乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠) )、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；(2(2） 阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂： 如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 RNAase分布广泛，极易污染样品，而分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不

5、宜失活。且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（皂土（bentonite ） 作用机制：作用机制：皂土带负电荷，能皂土带负电荷，能吸附吸附RNase，使其失活。使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：作用机制：与蛋白质中与蛋白质中His结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。 使用注意：使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。倍。 2）容易降

6、解，保存在）容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中； 3）提）提RNA时，时，0.1% DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。 4）剧毒）剧毒。（3) 3) 肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（MacaloidMacaloid) )（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-RibonucleosideRibonucleoside Complex, VRC) Complex, VRC)Home (1) (1) 高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎 (2) (2) 玻璃匀

7、浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 (3) (3) 超声波处理法超声波处理法 (4) (4) 液氮研磨法液氮研磨法 (5) (5) 化学处理法化学处理法(SDS(SDS、LDSLDS，吐温，吐温8080等）等） (6) (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）Home2.1 细胞的破碎细胞的破碎 2.2 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力吸力( (核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合) )、氢键和非、氢键和非极性的范德华力。极性的范德华力。 分离核酸分离核酸最困难最困难的是将

8、与核酸紧密结合的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 2.2.1 加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；使氢键破坏，核蛋白解聚； 2.2.2 加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； 2. 2.3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。并对核酸酶有抑制

9、作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。素和蔗糖的作用。 在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为为防止起泡和促使水相与有机相的分离防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一，再加上一定量的异戊醇（定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇酚：氯：异戊醇=25=25：2424：1 1）。 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧

10、化产物，例如红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。应戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意Home 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点优点： 改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。盐盐贮存液浓

11、度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 当核酸溶液的当核酸溶液的pHpH值大于值大于4 4时，核酸分子呈多聚阴离子时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与状态，它与1 1价或价或2 2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。不溶解，也不会被有机溶剂变性。 （1 1）乙醇）乙醇优点：优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。挥发除去，不影响以

12、后实验。缺点：缺点： 需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇）异丙醇优点：优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点缺点： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用发除去。所以，最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）优点：优点： 可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段。应用

13、片段。应用60006000相对分子质量相对分子质量的的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol10 mmol/L/L的的MgClMgCl2 2。 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质

14、杂质与杂质与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀，共沉淀，影响以后的实验。一般使用影响以后的实验。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min， DNADNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。Home 2.4.1 2.4.1 紫外分光光度法测紫外分光光度法测DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污

15、染。琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于测定浓度应大于0.25 g/ml 。 结论：结论：在波长在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度值的吸光度相当于双链相当于双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 gg/ml/ml；RNARNA为为40 ug40 ug/ml/ml。a a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加水至特定体积后，样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。转入分光光度计的石英比色杯中。b b分光光度计先用一定量的水分光光度计先用一定量的水校正零点校正零点。

16、c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。 双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l(g/l) = OD) = OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50/100050/1000； RNARNA样品浓度样品浓度(g/l(g/l) = OD) = OD260260核酸稀释核酸稀释倍数倍数40/100040/1000。e e分析纯度。分析纯度。A：测：测DNA： 纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1) OD260/OD2

17、80大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注： 可能可能出现既含蛋白质又含出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比值为溶液比值为1.8的情况。的情况。 测定结果分析测定结果分析B B：测：测RNARNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之之间，间，

18、OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；白质或酚的污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及时表明有小分子及盐存在。盐存在。 原理：原理：DNADNA、RNARNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基嵌入碱基平面之间后，平面之间后，DNADNA、RNARNA

19、样品在紫外光激发下，可样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度用一系列已知的不同浓度DNADNA溶液作标准对照，溶液作标准对照，可比较出被测可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。 注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。Home(1) (1) 对对DNADNA DNADNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保存；保存； 长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 对对RNA RNA

20、 RNARNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc0.3 mol/L NaAc (pH5.2) (pH5.2)或双蒸灭菌或双蒸灭菌水中，水中，-70 -70 保存保存; ; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ; 在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷氧钒核糖核苷复合物复合物) )冻贮于冻贮于-70,-70,可保存数年。可保存数年。Home 基因组DNA特点：线性DNA，长度长，在溶液中黏稠，沉淀后难溶解，易断裂 酚抽提法：以含EDTA，SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞

21、，再经蛋白酶K处理，以pH8.0Tris饱和酚抽提DNA，再根据需要纯化及浓缩。 甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质，再以透析除去杂质 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE 其他方法：异丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法 DNA样品的进一步纯化：透析，沉淀，电泳，选择性沉淀 片段回收： 原则：提高回收率，去除杂质污染 从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电泳法，电泳洗脱法，冷冻挤压法 从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡 质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和抗变性能力更强 方

22、法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。碱裂释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、解法有操作简便、快速、得率高的优点。得率高的优点。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒所有分离质粒DNA的方法都包括的方法都包括3个基本步骤：培养细菌个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要有时还要求纯化质粒求纯化质粒DNA，根据实验所

23、需，根据实验所需)选择哪一种方法主要取选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。用于纯化的技术和实验要求。 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和复

24、制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起） q对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤乙醇沉淀乙醇沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂： 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTrisHCl（pH8.0）10mM EDTA 作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II 0.2M NaOH 1%SDS（新鲜配制） 作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。溶液III

25、 5M KAC：乙酸钾：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85混合 作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀， K可中和DNA平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉

26、淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的200l溶液, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开

27、倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。 纯化 CsCL-EB法 聚乙二醇沉淀法 柱层析法 回收：与基因组DNA类似 制备条件与环境：无RNase 总RNA的分离与纯化：在最初阶段，尽可能快的灭活细胞内的RNase的活性 异硫氰酸胍酚氯仿一步法 同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法 其他方法 Oligo（dT）-纤维素柱层析法 Oligo（dT）-纤维素液相结合离心法 其他方法